摘要：[目的]高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)中的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)，克羅彭斯特德菌屬(Kroppenstedtia)是堆積酒醅中的優(yōu)勢細菌屬，研究其生長和代謝特征對于理解堆積發(fā)酵的關(guān)鍵作用至關(guān)重要。
[方法]采用胰酪大豆蛋白胨(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基從酒醅中篩選克羅彭斯特德菌，通過形態(tài)學和16S rRNA基因測序確定其分類學地位，結(jié)合菌株純培養(yǎng)及不同溫度(45℃和50℃)下的高粱固態(tài)發(fā)酵實驗，研究其生長和揮發(fā)性化合物代謝特征。
[結(jié)果]從醬香型白酒堆積酒醅中分離篩選到3株克羅彭斯特德菌，經(jīng)鑒定為象牙色克羅彭斯特德菌(Kroppenstedtia eburnea)。液態(tài)培養(yǎng)時菌株K.eburnea 1613促進吡嗪類物質(zhì)的產(chǎn)生，為對照的2.66倍。在固態(tài)發(fā)酵高粱中檢出的揮發(fā)性化合物主要為醇類和酸類，總含量隨發(fā)酵時間的推移而逐漸增加。50℃發(fā)酵高粱有利于醇類、酸類和吡嗪類物質(zhì)的積累，而45℃下酯類物質(zhì)含量較高。3株菌以高粱為基質(zhì)進行固態(tài)發(fā)酵時主要代謝產(chǎn)物是苯乙醇和異戊酸，其中K.eburnea 1615在50℃下發(fā)酵15 d時苯乙醇和異戊酸含量最高，為(31.17±0.14)μg/g和(16.75±0.76)μg/g。菌株K.eburnea 6E22在50℃下發(fā)酵15 d時2,5-二甲基吡嗪含量最高，為(1.67±0.14)μg/g。菌株K.eburnea 1613在發(fā)酵15 d時己酸含量最高，為(3.74±0.19)μg/g。50℃下發(fā)酵高粱自身中醛酮類物質(zhì)積累明顯。偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)顯示，溫度和時間對3株菌發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物的組成有顯著影響。
[結(jié)論]象牙色克羅彭斯特德菌有助于堆積發(fā)酵酒醅風味化合物的產(chǎn)生，特別是醇類、酸類和吡嗪類等醬香型白酒特征風味物質(zhì)。
醬香型白酒以其香氣幽雅細膩、酒體醇厚豐滿著稱，其生產(chǎn)工藝特點是“四高兩長，一大一多”，即高溫堆積，高溫餾酒，高溫發(fā)酵，高溫制曲；生產(chǎn)周期長，儲酒時間長；用曲量大，多輪次取酒。高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)的關(guān)鍵工序，被稱為是“二次制曲”過程，主要起到網(wǎng)羅環(huán)境中的微生物、生成重要醬香風味化合物或前體物質(zhì)以及糖化發(fā)酵作用。
克羅彭斯特德菌屬(Kroppenstedtia)是醬香型白酒大曲生產(chǎn)和酒醅堆積發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌，相對豐度約為3.49%?41.73%?？肆_彭斯特德菌屬屬于芽孢桿菌綱(Bacilli)的高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)，基于EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/identify)，目前該屬有4個分類學地位明確的種，包括象牙色克羅彭斯特德菌(K.eburnea)、廣州克羅彭斯特德菌(K.guangzhouensis)、肺克羅彭斯特德菌(K.pulmonis)和血克羅彭斯特德菌(K.sanguinis)，主要是從塑料表面、血液、土壤和腦脊液分離出來的，均為好氧耐熱微生物，其中K.guangzhouensis最適生長溫度為50℃，其余均為45℃。溫度是影響醬香型白酒堆積發(fā)酵質(zhì)量的重要因素，能反映堆積發(fā)酵過程是否正常，在堆積過程酒醅溫度最高能達到50℃左右。
目前基于宏轉(zhuǎn)錄組學和宏基因組學研究發(fā)現(xiàn)，克羅彭斯特德菌屬是醬香型白酒釀造過程脂肪酸生物合成的功能微生物。對6個輪次大曲酶編碼基因進行功能注釋發(fā)現(xiàn)，象牙色克羅彭斯特德菌編碼α-淀粉酶，能參與大曲發(fā)酵過程的碳水化合物代謝。此外，斯皮爾曼相關(guān)性分析顯示，在大曲發(fā)酵過程中克羅彭斯特德菌屬與氨基酸、乙酸等風味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)。然而，克羅彭斯特德菌屬在菌株水平的代謝特性及其在醬香型白酒堆積過程中對風味的貢獻尚不清楚。
因此，本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)手段從醬香型白酒堆積酒醅中分離、篩選克羅彭斯特德菌，結(jié)合冷場掃描電鏡及測序手段鑒定其形態(tài)特征和分類學地位；在純培養(yǎng)條件下研究菌株的生長和揮發(fā)性化合物代謝情況；最后，以醬香型白酒釀造原料紅纓子高粱為基質(zhì)進行15 d恒溫固態(tài)發(fā)酵實驗，探究克羅彭斯特德菌在不同溫度(45℃和50℃)條件下?lián)]發(fā)性化合物的產(chǎn)生情況。
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品采集
本研究中所用的酒醅樣品取自某醬香型白酒酒廠，分別取自醬香型白酒第三次堆積發(fā)酵的第1、4、9天的酒醅。每一個酒醅樣品取自距離地面50 cm的堆積酒醅，取樣深度為20 cm，三點取樣，每個點取約50 g酒醅，混勻后放入無菌自封袋。放冰袋4℃保存，送回實驗室進行后續(xù)微生物分離。
1.1.2主要試劑和儀器
叔戊醇(色譜級純度)，Sigma-Aldrich公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；胰酪大豆蛋白胨(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；定量PCR儀，ThermoFisher Scientific公司；Spark多模微孔板閱讀器，Tecan公司；冷場掃描電鏡，HITACHI公司。
1.1.3培養(yǎng)基
調(diào)研克羅彭斯特德菌屬相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，常用TSB培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基。
TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨17.0，氯化鈉5.0，大豆蛋白胨3.0，磷酸氫二鉀2.5，葡萄糖2.5。固體培養(yǎng)基需添加質(zhì)量分數(shù)2.0%的瓊脂粉。滅菌條件為115℃、20 min。
固態(tài)發(fā)酵高粱培養(yǎng)基：向250 mL錐形瓶中加入100 g紅纓子高粱和80 mL去離子水，121℃滅菌30 min后，冷卻至50℃?zhèn)溆谩?
1.2酒醅中微生物的分離篩選及鑒定
稱取10 g堆積醅樣品，添加到裝有100 mL無菌生理鹽水和適量玻璃珠的250 mL三角瓶內(nèi)，45℃、180 r/min振蕩30 min，靜置10 min，待酒醅沉到瓶底后，獲得菌懸液。取上清液進行梯度稀釋(10?1?10?7)，取100μL菌懸液涂布在TSB固體培養(yǎng)基上，放置在45℃培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)2?3 d。待菌落長出后，每隔一段時間挑選不同菌落形態(tài)的單菌落，分離純化3次后接種到TSB液體培養(yǎng)基中，在恒溫搖床上45℃、180 r/min培養(yǎng)2 d。取2 mL菌液，根據(jù)細菌DNA快速提取試劑盒的說明書，提取菌株DNA用于物種鑒定，同時取0.9 mL菌液轉(zhuǎn)移到有0.9 mL 50%甘油的保種管里，置于?80℃冰箱保藏備用。
參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》的方法對克羅彭斯特德菌進行形態(tài)學和分子生物學鑒定。分子生物學鑒定以細菌的16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對提取的菌株DNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(25μL)：DNA模板1μL，2×Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，加無菌ddH2O至25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性7 min；95℃變性25 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物送至天霖生物科技無錫有限公司測序，將測序結(jié)果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的模式菌株進行同源比對。利用MEGA 7軟件基于鄰近法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以暹羅芽孢桿菌(Bacillus siamensis)KCTC 13613T的16S rRNA基因作為外源菌序列。
1.3菌株生長代謝特性
1.3.1生長曲線測定
將菌株在固體TSB培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，挑選單菌落在液體TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得生長活力良好的種子液。以1%接種量轉(zhuǎn)接到加有適量玻璃珠的裝有100 mL TSB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每隔4 h采集發(fā)酵液用于分析生長和代謝特征，以未接種的培養(yǎng)基為對照，每組設(shè)置3個平行。
吸取200μL發(fā)酵液至96孔板中，使用酶標儀測量600 nm處OD值。采用微量pH計(METTLER TOLEDO公司)測定pH值。將傳代3次的生長至對數(shù)生長期(OD600約為2.0)的菌液涂布在平板上，讓菌長滿整個平板。挑取菌體，用PBS緩沖液清洗3次，再用2.5%的戊二醛溶液固定2次，用冷場掃描電子顯微鏡觀察菌體的微觀形態(tài)。
1.3.2揮發(fā)性化合物測定
采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)測定菌液中揮發(fā)性化合物組成。取30 mL培養(yǎng)至平穩(wěn)期的菌液于50 mL離心管中，4℃、8 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液于20 mL頂空瓶中，加入2.3 g氯化鈉以及10μL 8.05 g/L的色譜級叔戊醇內(nèi)標液。
檢測條件：色譜柱為DB-Wax毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm)，載氣為He，流速為1 mL/min，進樣口溫度為250℃，解吸5 min，不分流進樣；氣相升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min升至60℃，再以10℃/min升至230℃，保持8 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度260℃，界面溫度200℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍25–350 amu。采用NIST17譜庫進行定性分析，采用內(nèi)標法計算各種物質(zhì)的相對含量。
1.4菌株固態(tài)發(fā)酵高粱的產(chǎn)香特征分析
1.4.1不同溫度條件下固態(tài)發(fā)酵高粱
菌株按1%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至平穩(wěn)期，4℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，利用PBS緩沖液洗滌菌體2次并重懸。向固態(tài)發(fā)酵高粱培養(yǎng)基中分別加入20 mL菌株重懸液，混勻后分別放入45℃和50℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以加入20 mL無菌水為空白對照，每個處理設(shè)置3個平行。在發(fā)酵第0、4、7和15 d時分別取樣，置于?80℃冰箱備用。
1.4.2菌株固態(tài)發(fā)酵高粱的揮發(fā)性化合物測定
采用HS-SPME-GC-MS檢測菌株在不同溫度條件下發(fā)酵高粱的揮發(fā)性化合物組成。取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，充分渦旋振蕩混勻，4℃超聲處理30 min，8 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液至20 mL頂空瓶中，加入2.3 g氯化鈉以及10μL 8.05 g/L的色譜級叔戊醇內(nèi)標液。HS-SPME-GC-MS運行程序與分析方法見1.3.2。
1.5數(shù)據(jù)分析
利用Microsoft Excel 2016、Origin 2021等軟件對獲得的原始數(shù)據(jù)進行處理，使用SIMCA 14.1軟件對揮發(fā)性化合物進行多元統(tǒng)計分析，利用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖并對數(shù)據(jù)進行方差分析，使用派森諾云平臺(https://www.genescloud.cn/login)進行揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖繪制，對每個揮發(fā)性化合物分別采用Z-score方法標準化。
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（一）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（二）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（三）
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