1材料與方法
1.1材料
1.1.1植物和病原菌
桑枝：2022年秋采自重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院(29°48′58″N，106°24′51″E)，桑樹品種為抗性品種‘川桑7637’。
病原菌：S.sclerotiorum PZ-2為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，Botryotinia fuckeliana、Colletotrichum gloeosporioides、Colletrichum lagenarium、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、旋孢腔菌(Cochiobolus sativus)、Thanatephorus cucumeri、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)等為實(shí)驗(yàn)室收集保存菌株。
1.1.2培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，瓊脂15.0–20.0。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂15.0–20.0。
PDB培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0。
胰酪大豆胨瓊脂(tryptone soya agar,TSA)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨15.0，大豆胨5.0，NaCl 5.0，瓊脂15.0–20.0。
營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，NaCl 5.0，瓊脂15.0–20.0。
R2A瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：細(xì)菌蛋白胨0.5，可溶性淀粉0.5，酵母粉0.5，葡萄糖0.5，酸水解酪蛋白0.5，KH2PO4 0.3，丙酮酸鈉0.3，MgSO4 0.024，瓊脂15.0–20.0。
以上培養(yǎng)基均采用121℃滅菌20 min。
1.1.3主要試劑
KI-I2染液：60 mg/mL KI溶液與10 mg/mL I2溶液以體積比1:1混合。
200 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid,HEPES)的配制：用1 mol/L NaOH溶液將1 mol/L HEPES溶液pH調(diào)至6.8–8.2，向20 mL 1 mol/L HEPES中加入80 mL水，得到200 mmol/L HEPES。
1.2桑樹內(nèi)生拮抗菌的分離及篩選
1.2.1內(nèi)生菌分離純化
利用植物組織培養(yǎng)法分離內(nèi)生菌，具體方法：取健康的‘川桑7637’枝條，剪至5–6 cm長(zhǎng)，置于75%乙醇中浸泡1–2 min，取出后于酒精燈火焰上燃盡表面乙醇，置于PDA培養(yǎng)基表面滾動(dòng)數(shù)圈后28℃條件下培養(yǎng)，以驗(yàn)證表面滅菌是否徹底。隨后用無菌刀片將其分三層，分別置于LB、TSA、NA、R2A培養(yǎng)基上28℃條件下培養(yǎng)，待植物組織周圍長(zhǎng)出菌落后，通過平板劃線法分離純化內(nèi)生細(xì)菌。
1.2.2桑椹菌核病拮抗菌初篩
利用平板對(duì)峙法篩選對(duì)S.sclerotiorum PZ-2有拮抗效果的內(nèi)生菌。用打孔器取直徑8 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌餅，接種于培養(yǎng)基中央，在距中央2.5 cm處的4個(gè)方向分別劃線接種不同內(nèi)生菌，28℃培養(yǎng)，觀察病原菌生長(zhǎng)情況，篩選對(duì)S.sclerotiorum PZ-2具有拮抗效果的內(nèi)生菌。
1.2.3桑椹菌核病拮抗菌復(fù)篩
對(duì)初篩拮抗效果較好的拮抗菌進(jìn)行平板對(duì)峙法復(fù)篩。用打孔器取直徑5 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌餅，接種于培養(yǎng)基中央，在距中央2 cm兩側(cè)對(duì)稱處劃線接種拮抗菌，以只接種病原菌的平板為對(duì)照，25℃培養(yǎng)4 d，測(cè)量與待測(cè)細(xì)菌劃線垂直方向的病原真菌菌落直徑，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并按公式(1)計(jì)算抑菌率。
抗菌率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-實(shí)驗(yàn)組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）*100 公式(1)
1.3桑椹菌核病拮抗菌的鑒定
1.3.1形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定
利用平板劃線法將篩選獲得的拮抗菌接種于PDA和LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，觀察其菌落形態(tài)。在LB上培養(yǎng)24 h和48 h后，分別進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色。生理生化特征檢測(cè)采用新型微生物微量生化鑒定管試劑盒(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。
1.3.2基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析
提取目的菌株基因組，在1.5 mL離心管中加入30μL DNA提取液(PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent試劑盒)(Applied Biosystems公司)，挑取適量菌落與DNA提取液混合均勻，100℃金屬浴10 min，之后12 000 r/min離心3 min，取20μL上清液作為模板備用。
以目的菌株基因組為模板，利用16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)擴(kuò)增拮抗菌16S rRNA基因序列。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃15 s，55℃15 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，將獲得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA 5.0軟件基于16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.4拮抗菌抑菌譜測(cè)定
以實(shí)驗(yàn)室保存的常見植物病原菌為靶標(biāo)菌，用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，接種于培養(yǎng)基中央，在距離中央2 cm處左右兩側(cè)接種拮抗菌，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，25℃培養(yǎng)，參照公式(1)計(jì)算抑菌率。
1.5拮抗菌對(duì)桑椹菌核病的離體防效實(shí)驗(yàn)
微調(diào)后進(jìn)行離體防效實(shí)驗(yàn)。
1.5.1菌懸液及發(fā)酵上清液制備
挑取拮抗菌單菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)過夜，將種子液接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)過夜后，將發(fā)酵液12 000 r/min離心3 min收集菌體，用無菌水重懸到OD600為0.6(108 CFU/mL)制成菌懸液。
將拮抗菌接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，取發(fā)酵液12 000 r/min離心30 min后，上清液過0.22μm濾膜，獲得無菌發(fā)酵上清液。
1.5.2離體防效實(shí)驗(yàn)
將新鮮桑椹置于75%乙醇浸泡20–30 s，無菌水洗去乙醇，無菌濾紙吸干水分；無菌針頭刺破桑椹后分別在純水、LB液體培養(yǎng)基、拮抗菌菌懸液、拮抗菌發(fā)酵上清液、甲基硫菌靈(稀釋750倍)中浸泡30 min，取出置于培養(yǎng)皿自然晾干，取3塊直徑為8 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌餅接種在桑椹上針頭刺破處，保鮮膜包裹后放入組培瓶，室溫(15–20℃)靜置培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含5個(gè)桑椹。室溫培養(yǎng)2 d后取下保鮮膜，去除菌餅，觀察記錄并按公式(2)計(jì)算病情指數(shù)，菌懸液處理組和甲基硫菌靈以純水為對(duì)照，發(fā)酵上清液處理組以LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，均按公式(3)計(jì)算防效。
根據(jù)處理后桑椹發(fā)病時(shí)的表面菌絲覆蓋率，將發(fā)病桑椹進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，無發(fā)病桑椹；1級(jí)，桑椹表面菌絲覆蓋率0%–25%；2級(jí)，桑椹表面菌絲覆蓋率25%–50%；3級(jí)，桑椹表面菌絲覆蓋率50%–75%；4級(jí)，桑椹表面菌絲覆蓋率75%–100%。
1.6拮抗菌抑菌機(jī)理初探
1.6.1拮抗菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用
將拮抗菌接種到PDB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)4 d后，取發(fā)酵液12 000 r/min離心30 min，隨后上清液過0.22μm濾膜，獲得無菌發(fā)酵上清液。
利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定拮抗菌無菌發(fā)酵上清液對(duì)桑椹菌核病原菌S.sclerotiorum PZ-2的抑制效果。將病原菌S.sclerotiorum PZ-2分別接種至含有50%、20%、10%、5%、3%和2%拮抗菌無菌發(fā)酵上清液的PDA平板，25℃培養(yǎng)48 h，以未添加無菌發(fā)酵上清液的PDA平板為對(duì)照，參照公式(1)計(jì)算抑菌率，并在顯微鏡下觀察S.sclerotiorum PZ-2菌絲形態(tài)。
1.6.2拮抗菌對(duì)病原菌糖原積累的影響
通過糖原染色測(cè)定拮抗菌對(duì)病原菌糖原積累的影響。在鋪有玻璃紙的PDA平板中央接種直徑5 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌餅，距中心2 cm處兩側(cè)接種拮抗菌，取25℃對(duì)峙培養(yǎng)1、2、3、5 d后的S.sclerotiorum PZ-2菌絲置于載玻片上，用KI-I2染液染色1 min后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，顏色越深代表菌絲糖原含量越多。以在PDA平板上培養(yǎng)相同時(shí)間的S.sclerotiorum PZ-2作為對(duì)照。
1.6.3拮抗菌對(duì)病原菌胞內(nèi)活性氧的影響
采用DCFH-DA活性氧熒光探針測(cè)定對(duì)峙培養(yǎng)1、2、3、5 d的S.sclerotiorum PZ-2菌絲內(nèi)活性氧含量。將S.sclerotiorum PZ-2菌絲置于200 mmol/L HEPES緩沖液中靜置浸潤(rùn)20 min后，轉(zhuǎn)移至15μmol/L的DCFH-DA溶液(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，25℃黑暗標(biāo)記1 h，制片，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515 nm。
1.6.4拮抗菌對(duì)病原菌基因表達(dá)的影響
根據(jù)1.6.1、1.6.2和1.6.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)拮抗菌對(duì)S.sclerotiorum PZ-2基因組中糖代謝、抗氧化酶和細(xì)胞壁成分相關(guān)基因表達(dá)情況的影響。
按1.6.2方法收集病原菌菌絲，依據(jù)Omega Fungal RNA Kit R6840(Omega Bio-Tek公司)說明書提取S.sclerotiorum PZ-2菌絲總RNA。
利用一步反轉(zhuǎn)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。反轉(zhuǎn)體系：5×All-in-one qRT SuperMix 4μL，Enzyme Mix 1μL，RNA template 1μg，RNase-free ddH2O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)程序：50℃15 min；85℃5 s。
參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中S.sclerotiorum基因組選取與糖代謝有關(guān)的基因Gene_9536(己糖激酶)、Gene_3455(糖基轉(zhuǎn)移酶家族20)、Gene_7772(葡萄糖磷酸變位酶)，與病原菌抗氧化相關(guān)的基因Gene_5305(過氧化氫酶相關(guān)的免疫反應(yīng)性)、Gene_4935(過氧化氫酶)、Gene_1287(過氧化物酶體)，與細(xì)胞壁組分合成相關(guān)的基因Gene_13(糖基轉(zhuǎn)移酶、纖維素酶)、Gene_11361(幾丁質(zhì)合成酶2)、Gene_622(細(xì)胞壁)。利用軟件Primer 5設(shè)計(jì)以上基因引物，內(nèi)參基因和各基因的引物序列如表1所示。
表1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病原菌基因表達(dá)的引物序列
實(shí)時(shí)熒光定量PCR：每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)含3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq II(2×)10μL，正、反向引物(10μmol/L)各0.8μL，cDNA模板5μL，RNase-free ddH2O 3.4μL。反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃10 s，40個(gè)循環(huán)；60℃30 s。
1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析
數(shù)據(jù)均采用Excel 2018進(jìn)行分析計(jì)算，利用GraphPad Prism 8中t檢驗(yàn)對(duì)相對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行顯著性分析并作圖。
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