銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)存在于自然界中，是人體內(nèi)常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，同時(shí)也是最容易產(chǎn)生生物膜的革蘭陰性桿菌之一。近年來(lái)，由于抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致其耐藥性菌株頻繁出現(xiàn)。碳青霉烯類(lèi)抗生素通常被用作臨床干預(yù)由銅綠假單胞菌引起的多重耐藥感染的最后手段。大量耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的出現(xiàn)給臨床治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。
銅綠假單胞菌嚴(yán)重影響免疫功能低下的患者，是造成接受化療的中性粒細(xì)胞減少性癌癥患者菌血癥和敗血癥的主要原因，在各種皮膚感染中包括糖尿病足、燒傷創(chuàng)面、角膜潰瘍、外耳道感染性中也經(jīng)常出現(xiàn)。此外，患有囊性纖維化的患者通常會(huì)慢性感染銅綠假單胞菌，最終導(dǎo)致患者因肺功能衰竭而死亡。
噬菌體(bacteriophage，phage)是一類(lèi)感染細(xì)菌的病毒，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、數(shù)量龐大、分布廣泛，在治療抗生素耐藥細(xì)菌方面，噬菌體有潛力作為抗菌劑用于多重耐藥菌引起的感染。噬菌體具有裂解能力強(qiáng)、繁殖快、成本低、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)不僅可以高效裂解細(xì)菌，還可以與多種抗生素協(xié)同作用，增強(qiáng)殺菌效果。目前已經(jīng)有多個(gè)噬菌體以及噬菌體與抗生素聯(lián)合應(yīng)用于臨床并治療成功的案列，故噬菌體療法被認(rèn)為是一種最具有希望用來(lái)對(duì)抗日益嚴(yán)重的耐藥細(xì)菌的生物防控手段。
銅綠假單胞菌Pa021的分離及鑒定
實(shí)驗(yàn)菌株是從江蘇省婦幼保健院污水處理中心分離獲得。取少量污水樣本涂布至血平板上，35℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落，四區(qū)劃線(xiàn)至血平板上，直至菌落生長(zhǎng)均一。于VITEK進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，確定為銅綠假單胞菌，將其命名為Pa021。銅綠假單胞菌Pa021藥敏結(jié)果見(jiàn)表1。銅綠假單胞菌Pa021菌落生長(zhǎng)形態(tài)見(jiàn)圖1。
圖1是實(shí)施例宿主菌銅綠假單胞菌Pa021的菌落生長(zhǎng)狀態(tài)圖。
圖2是噬菌體Phage_Pae01的一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。
噬菌體Phage_Pae01的一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)
隨機(jī)挑取1個(gè)宿主菌Pa021單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期；噬菌體與細(xì)菌按照MOI為0.01混合，室溫反應(yīng)8min，10000rpm離心30s，留沉淀；吸取3mL LB液體培養(yǎng)基吹打沉淀，室溫10000rpm離心30s，留沉淀后再次吹打；最后，用預(yù)熱的5mL LB液體培養(yǎng)基充分重懸；隨后在37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔5min取樣一次取至30min，然后每隔10min取樣一次，取5次至100min，取出的100μL樣品12000rpm離心2min后收集上清；所得濾液置于4℃冰箱中，100min后，將各個(gè)時(shí)間所得的濾液倍比稀釋?zhuān)p層瓊脂平板法測(cè)滴度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。得知：噬菌體Phage_Pae01的潛伏期為30min，裂解期為20～30min，隨后進(jìn)入平穩(wěn)期。
噬菌體Phage_Pae01的殺菌曲線(xiàn)繪制
取150μL過(guò)夜培養(yǎng)宿主菌液加入15mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600為0.50。取無(wú)菌96孔板，在孔中加入140μL LB液體培養(yǎng)基及30μL對(duì)數(shù)期宿主菌液，按不同的MOI(10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001)做好標(biāo)記，分別加入109-104滴度的噬菌體懸液30μL，對(duì)照組使用LB液體培養(yǎng)基代替噬菌體，每個(gè)孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置溫度37℃，每間隔30min測(cè)一次OD600，共測(cè)18h。與不加噬菌體的對(duì)照組相比，在不同的MOI條件下，細(xì)菌的生長(zhǎng)逐漸被抑制并被殺滅，體現(xiàn)噬菌體Phage_Pae01的殺菌效果較強(qiáng)。
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