2.4山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響
山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，在無山梨醇添加的DPA培養(yǎng)基上，WT菌株和KO菌株的菌絲形態(tài)無明顯差別。在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌絲形態(tài)沒有明顯變化，而WT菌株的菌絲細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的小型顆粒狀物質(zhì)。在1.5 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌絲細(xì)胞內(nèi)也出現(xiàn)了大量的小型顆粒狀物質(zhì)，而WT菌株的菌絲細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的大型顆粒狀物質(zhì)。在2.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌絲變粗，原生質(zhì)體濃縮成顆粒狀，而WT菌株的菌絲細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很多空隙。
2.5山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)沉積的影響
由于脂類物質(zhì)是玉米大斑病菌菌絲內(nèi)主要的滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)[13]，在圖3中出現(xiàn)的顆粒狀物質(zhì)極有可能是脂類物質(zhì)的積累。因此，本研究利用油紅O染色劑，對WT菌株和KO菌株在2.0 mol/L山梨醇高滲脅迫條件下菌絲細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)的沉積情況進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，與高滲脅迫處理前相比，2.0 mol/L山梨醇高滲脅迫后，WT菌株菌絲細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量明顯增多，并且脂滴體積明顯增加，而KO菌株的菌絲細(xì)胞變粗膨大，脂滴數(shù)量有所減少，但脂滴體積顯著變大。脂滴的分布情況也明顯不同，在高滲脅迫處理前，WT菌株和KO菌株的脂滴分布都不均勻，但山梨醇高滲脅迫處理后，WT菌株的脂滴大小及分布都比較均勻一致，而KO菌株大脂滴和小脂滴并存且分布極不均勻，位于中部或偏于某一側(cè)。該試驗結(jié)果與圖3的表現(xiàn)基本一致。
圖3山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲形態(tài)的影響
圖4山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌絲細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)沉積的影響
3討論與結(jié)論
山梨醇是一種重要的滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)，它可以與水、甘油和丙二醇混溶，因此具有與NaCl、KCl等鹽分子不同的化學(xué)性質(zhì)[18]。在植物的耐鹽脅迫研究中，200μg/mL山梨醇浸種處理可促進(jìn)無花果種子萌發(fā)，加速可溶性糖和脯氨酸積累，增強(qiáng)無花果幼苗滲透調(diào)節(jié)，有效降低鹽脅迫對幼苗細(xì)胞造成的傷害，提高無花果幼苗耐鹽性[19]。因此，山梨醇滲透脅迫與鹽脅迫具有不同的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制。
在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，在相同的鹽離子濃度條件下，與野生型(WT)菌株相比，STK1基因敲除突變體(KO)菌株的菌絲生長緩慢，細(xì)胞內(nèi)容物減少，生理狀況降低[12,14]。但是本試驗的研究結(jié)果表明，在1.0 mol/L山梨醇滲透脅迫條件下，玉米大斑病菌KO菌株生長狀況與WT菌株沒有顯著差異，只有當(dāng)山梨醇濃度提高到1.5 mol/L以上時，才顯著抑制了KO菌株的菌絲生長速度。
因此，STK1基因在山梨醇高滲脅迫調(diào)節(jié)過程中存在一個滯后的信號應(yīng)答過程。另外，與非滲透脅迫相比，在1.0 mol/L山梨醇滲透脅迫條件下，KO菌株菌絲生長速度不但未受到抑制，反而得到促進(jìn)，說明1.0 mol/L山梨醇處理使玉米大斑病菌菌絲恢復(fù)了部分滲透脅迫調(diào)節(jié)功能，即1.0 mol/L山梨醇處理可能增強(qiáng)了菌絲的滲透脅迫調(diào)節(jié)能力，“補(bǔ)償”了STK1被敲除后造成的某些功能障礙。該試驗結(jié)果與山梨醇是桃[20]、煙草[21]等植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和醫(yī)藥領(lǐng)域滲透劑[22]的結(jié)論是一致的，并且Stavniichuk等[23]研究表明，山梨醇通路與MAPK通路可協(xié)同調(diào)控糖尿病的發(fā)生。
但是，更高濃度的山梨醇對這一未知途徑也產(chǎn)生了一定的阻遏作用，使玉米大斑病菌的滲透脅迫調(diào)節(jié)能力受到了不可逆的抑制作用，不僅菌落生長速度受到抑制，而且細(xì)胞壁色素的合成受到干擾，菌絲顏色變淺；細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解能力下降，出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)積累。研究表明，參與滲透脅迫調(diào)節(jié)的細(xì)胞壁色素物質(zhì)為黑色素，而這些顆粒狀物質(zhì)極有可能是滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)[24-25]。王梅娟等[13]研究表明，玉米大斑病菌的滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)主要為甘油，而真菌細(xì)胞內(nèi)甘油主要來自于脂肪的降解。因此，菌絲細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)沉積形成的脂滴大小和分布與滲透脅迫調(diào)節(jié)能力密切相關(guān)。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，山梨醇高滲脅迫條件下，脂類物質(zhì)的沉積與顆粒狀物質(zhì)的分布基本一致。利用油紅O染色觀察脂類物質(zhì)在菌絲內(nèi)的沉積情況，發(fā)現(xiàn)STK1基因缺失后脂滴的大小及分布均與野生型菌株不同，因此，STK1基因很可能通過調(diào)控脂類物質(zhì)合成進(jìn)行滲透脅迫調(diào)節(jié)。
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