1.2.3生長曲線的測定
取250mL三角瓶，裝入100mL無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按5%的接種量加入枯草芽孢桿菌種子液，混勻，并在37°C下以180rpm的振蕩速度孵育，當(dāng)細(xì)胞密度達到OD600 0.3時，將180μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至100孔板的每個微孔中，其中含有20μL 10倍連續(xù)稀釋的噬菌體。將板立即置于Bioscreen C自動生長曲線分析儀上。在接入菌種后的0 h、1.5 h、3 h、4h、6h、8h、10h、12 h、14 h、16 h以及20 h無菌條件下取出適量培養(yǎng)液，通過測量細(xì)菌的吸光度（OD600），可以了解噬菌體感染對細(xì)菌生長的影響，記錄結(jié)果并以時間為橫坐標(biāo)，OD420為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。每組3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。
1.2.4耐酸性試驗
以pH值為7.4的PBS緩沖液為基礎(chǔ)的營養(yǎng)肉湯，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的培養(yǎng)基。取枯草芽孢桿菌菌液1mL加入9mL上述梯度pH值的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，對照組則加入9mL的滅菌生理鹽水。置于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，分光光度計420 nm波長處測定OD值，將不同pH值的OD值與相應(yīng)空白對照OD值之比記為該菌株的存活率。每組3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。
1.2.5耐高溫試驗
在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中按5%的接種量加入枯草芽孢桿菌種子液，分別置入37℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴鍋中作用10min，冷卻后于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9、15和20 h，測定其OD420值，觀察和記錄生長情況。每組3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。
1.2.6耐膽鹽試驗
在膽鹽濃度分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，按5%接種量加入枯草芽孢桿菌，于37℃震蕩培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18 h，在420 nm波長下測定吸光度，不同膽鹽濃度的OD420值與相應(yīng)空白對照OD420值之比為該菌株的存活率。每組3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。
1.2.7發(fā)酵試驗
1.2.7.1菌液的制備
將10mL含有0.1%吐溫80的無菌水分別倒入枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基上，用接種環(huán)將斜面上的菌種和孢子刮下，置入盛有90mL無菌水的三角瓶中，用磁力攪拌器將其攪拌均勻，適當(dāng)稀釋，使密度達到1×107cfu/mL。
1.2.7.2菌液的接種
飼料經(jīng)粉碎后，過60目篩，稱取60 g飼料裝入100mL三角瓶中，高壓滅菌25min。冷卻后將飼料粉打散，接入1×107cfu的發(fā)酵種子液，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每組設(shè)3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。
1.2.7.3發(fā)酵飼料的酸度及酶活性測定
發(fā)酵飼料的酸度、淀粉酶活性、蛋白酶活性和纖維素酶活性測定主要參照鐘青萍等、吳勝蓮等和國家輕工行業(yè)、農(nóng)業(yè)部酶活力測定相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法進行。
1.2.8數(shù)據(jù)處理
檢測不同處理組和對應(yīng)對照組在OD420波長時的吸光度，用兩者的比值代表芽孢桿菌存活率。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間的差異顯著性比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1枯草芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)觀察
該株枯草芽孢桿菌呈革蘭氏陽性，在接種后12 h內(nèi)，桿端鈍圓，單生或呈短鏈狀（圖1-A）。在接種后48 h，出現(xiàn)芽孢，且芽孢一般生在菌體中間或兩端，呈橢圓形或長筒形（圖1-B）。呈現(xiàn)典型的枯草芽孢桿菌形態(tài)特征。
圖1菌株的形態(tài)觀察
2.2菌株的生長曲線和抗逆性能觀察
對生長曲線觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株無明顯的生長延滯期，生長對數(shù)期為0～6 h，生長穩(wěn)定期為6～10 h，生長衰亡期為第10小時以后（圖2-A）。以1.5 h的OD420為標(biāo)準(zhǔn)，不同時間點的OD420值與其均差異極顯著（P＜0.01）。
菌株分別經(jīng)37℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴處理10min后，在培養(yǎng)的9、15和20 h測定菌液OD420，發(fā)現(xiàn)隨著處理溫度的升高，同一時間點的吸光度下降（圖2-B）。但在培養(yǎng)9 h后，吸光度與37℃處理組相比差異不顯著（P＞0.05）。而在培養(yǎng)15 h和20 h后，不同處理組與37℃處理組間差異極顯著（P＜0.01）。存活率則隨處理溫度的升高而逐漸降低，分別為90.83%、86.81%和87.26%。
該菌株在pH值為2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時存活率最低，僅為59%，說明酸性環(huán)境對其生長有一定的影響。隨著培養(yǎng)液pH值的逐漸升高，存活率明顯增加。在培養(yǎng)液pH值為7.5時，菌株的存活率最高，達150%（圖2-C）。說明該菌株最適宜在中性環(huán)境中生長。
該菌株在膽鹽濃度分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，存活率隨膽鹽濃度升高而逐漸降低。最高為131.22%，最低為115.45%，但均高于100%，說明該菌株具有較強的耐膽鹽能力（圖2-D）。
圖2菌株生長特性觀察
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