摘要西瓜(Citrullus lanatus)是最受歡迎的水果之一，隨著人們對(duì)生活品質(zhì)的不斷追求，提高產(chǎn)品質(zhì)量已成為農(nóng)作物高銷量的關(guān)鍵因素。植物根際促生菌是一類能夠促進(jìn)植物吸收土壤中營(yíng)養(yǎng)元素并提高植物健康的有益細(xì)菌。為了探究貝萊斯芽胞桿菌(Bacillus velezensis)菌株WB對(duì)西瓜植株的促生效應(yīng)。本研究以菌株WB和西瓜種子為材料，使用功能性培養(yǎng)基解析菌株WB的促生能力，采用種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)以及盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證菌株WB的促生效應(yīng)并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing,RNA-seq)技術(shù)闡釋菌株WB的促生機(jī)制。結(jié)果表明，貝萊斯芽胞桿菌WB具有產(chǎn)生長(zhǎng)素(indole-acetic acid,IAA)與纖維素酶的能力，還具有解磷、解鉀和固氮的能力。種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)和盆栽實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，菌株WB對(duì)西瓜植株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。此外，菌株WB上調(diào)了與植物促生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路中基因的表達(dá)，包括：半萜和三萜類生物合成、苯丙烷類生物合成和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；參與促進(jìn)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄因子，如MYB(myeloblastosis)、NAC(NAM,ATAF,CUC)和Dof(DNA binding with one finger)等也被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了貝萊斯芽胞桿菌WB可以促進(jìn)西瓜生長(zhǎng)并對(duì)其促生機(jī)制進(jìn)行了闡釋，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
西瓜(Citrullus lanatus)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在數(shù)以萬(wàn)計(jì)的果蔬品類中深受大眾喜愛(ài)。植物根際促生菌(plant growth promotingrhizobacteria,PGPR)是一類有益植物健康的細(xì)菌，其能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，可以改變土壤中礦質(zhì)元素的形態(tài)使之有利于植物的吸收和利用，并能抑制植物病原體的活性。在過(guò)去的幾十年里，微生物防治劑的應(yīng)用已成為農(nóng)作物管理的重要措施之一。
其不僅能改變微生物的群落結(jié)構(gòu)，還能增強(qiáng)植物的免疫力，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，改善土壤環(huán)境。近年來(lái)，一些科研工作者不僅致力于發(fā)現(xiàn)新的微生物防治劑，還展開了大量有益微生物與植物相互作用的機(jī)制研究。PGPR可以通過(guò)多種機(jī)制增強(qiáng)植物生長(zhǎng)力并緩解生物和非生物脅迫，如產(chǎn)生水解酶，分泌植物激素，解磷、解鉀和固氮，以及誘導(dǎo)植物抗氧化酶活性，誘導(dǎo)抗性基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)等。用內(nèi)生芽胞桿菌(endophytic Bacillus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)預(yù)處理番茄(Solanum lycopersicum)植株，提高了其葉片中的生長(zhǎng)素(indole-acetic acid,IAA)水平，有助于番茄植株對(duì)抗斜紋夜蛾(Spodoptera litura)并促進(jìn)其生長(zhǎng)?？莶菅堪麠U菌(Bacillus subtil?is)AH18和地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)K11能夠調(diào)控纖維素酶基因(cellulase,cel)以抑制辣椒疫病病原菌辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的活性。此外，PGPR還可以產(chǎn)生不同的酶，例如，纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶，這些酶在維持土壤健康方面發(fā)揮了重要作用。
高地芽胞桿菌(B.altitudinis)MS16通過(guò)產(chǎn)生IAA、溶磷和分泌水解酶促進(jìn)芥菜(Brassica juncea)植株的生長(zhǎng)。固氮菌(Azospiril?lum lipoferum)菌株Az204和巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium var.phosphaticum)菌株P(guān)SB1顯著提高了水稻(Oryza sativa)植株的生物量、發(fā)芽率和活力指數(shù)，提升了芽中的N、P和K含量。3種PGPRs：莫氏假單胞菌(Pseudomonasmosselii)S6、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)S7和芽胞桿菌(Bacillus sp.)JBS-28 S10通過(guò)產(chǎn)生IAA、氨基環(huán)氧丙烷酸脫氨酶(aminocylopropanecarboxylic acid,ACC)和苷酸，增加土壤中可利用的磷，促進(jìn)了砷脅迫下水稻的生長(zhǎng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌(Ba?cillus velezensis)菌株WB能提高西瓜植株的免疫力，改變根際群落結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、鐵載體和蛋白酶，能夠引發(fā)氧化脅迫，抑制西瓜?；图獍牭毒?Fusarium oxysporum f.sp.niveum,Fon)的生長(zhǎng)。然而，目前還沒(méi)有研究闡明菌株WB對(duì)西瓜植株的促生長(zhǎng)機(jī)理。因此，本研究評(píng)估了貝萊斯芽胞桿菌菌株WB對(duì)西瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的促生效應(yīng)以及產(chǎn)生IAA、解磷、解鉀和固氮的能力，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討其促進(jìn)西瓜生長(zhǎng)的促生機(jī)制，為其在西瓜生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
西瓜(Citrullus lanatus)種子(益海星球)由黑龍江省齊齊哈爾市園藝研究所提供。貝萊斯芽胞桿菌(Bacillus velezensis)菌株WB(分離于西瓜根際)由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院微生物生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。供試土壤的理化性質(zhì)如下：pH 7.45、電導(dǎo)率0.639 ms/cm、有機(jī)質(zhì)66.4 g/kg、有效磷13.0mg/kg、有效氮354.67 mg/kg。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1貝萊斯芽胞桿菌WB促生長(zhǎng)能力的測(cè)定
1)分泌生長(zhǎng)素能力的測(cè)定。將WB菌株接種于NB液體培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)(30℃,120 r/min)24 h制作種子液，將1 mL的種子液接入含200 mg/L色氨酸的NB液體培養(yǎng)基中，在30℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)60 h，每6 h測(cè)量1次IAA分泌量，IAA的生長(zhǎng)曲線是y=0.002 4x-0.002 6，R2=0.999 1，采用分光光度法定量測(cè)定菌株的IAA產(chǎn)量
。
2)產(chǎn)纖維素酶能力的測(cè)定。將WB菌株接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)3 d，然后用1 g/L剛果紅染色1 h，將染色液倒掉，之后用1 mol/L氯化鈉溶液浸泡1 h，觀察是否有透明圈。如果WB菌株產(chǎn)生纖維素酶，菌落周圍會(huì)出現(xiàn)1個(gè)透明的圓圈。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
3)解磷、解鉀和固氮能力的測(cè)定。將WB菌株接種在NB液體培養(yǎng)基中，并在30℃下培養(yǎng)24 h。
將活化的菌株分別接種到NBRIP固體培養(yǎng)基和亞歷山大培養(yǎng)基中斑點(diǎn)培養(yǎng)5~7 d。觀察該菌株周圍是否有透明圈的形成，根據(jù)透明圈的有無(wú)判斷菌株解磷和解鉀的能力。將活化的WB菌株接入到90 mL阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基中，在30℃、120 r/min下分別培養(yǎng)2、4、6、8和10 d。提取其上清液，用總有機(jī)碳/總氮(TOC/TN)分析法測(cè)定總氮含量。
1.2.2種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)
用0.1%的升汞對(duì)西瓜種子表面消毒10 min，用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，30℃無(wú)菌催芽，待西瓜胚根長(zhǎng)至0.5 cm時(shí)將西瓜種子轉(zhuǎn)至濕熱、滅菌且鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑=9 cm)中，每皿5粒種子。設(shè)置以下處理，WB處理：將3 mL不同濃度(4.0×106,4.8×107,5.6×108和6.4×109 CFU/mL)的WB菌懸液加入培養(yǎng)皿中；以加入相同體積的無(wú)菌水為對(duì)照(CK)。培養(yǎng)皿中的液體保持使種子保持濕潤(rùn)但不浸泡的狀態(tài)，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。西瓜種子置于溫度為(28±2)℃，相對(duì)濕度為60%~70%，光暗周期為12 h/12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間每3 d分別補(bǔ)充1次WB菌懸液和無(wú)菌水，14 d后測(cè)量西瓜種子的胚根長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)周期為15 d，1個(gè)周期澆灌5次。
1.2.3植物促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
西瓜種子用0.1%升汞消毒10 min，無(wú)菌水清洗后在(28±2)℃下無(wú)菌催芽，待西瓜胚根長(zhǎng)至0.5 cm時(shí)播種至裝有滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽(10×10×8cm3)中，每缽種1株。幼苗置于溫度為(28±2)℃，相對(duì)濕度為60%~70%，光暗周期為12 h/12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)幼苗1片真葉時(shí)進(jìn)行以下處理：西瓜苗用40 mL的貝萊斯芽胞桿菌菌株WB懸浮液(6.25×106 CFU/mL)澆灌，每3 d澆1次(WB處理)；使用相同體積的無(wú)菌水處理作為對(duì)照(CK)。每個(gè)處理包括3個(gè)平行，每個(gè)平行10個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)西瓜植株30 d后取樣，測(cè)量根長(zhǎng)、株高、莖粗、根節(jié)數(shù)以及地上鮮重和地下干重。
1.2.4分子促生實(shí)驗(yàn)前處理
用0.1%的升汞對(duì)西瓜種子表面消毒10 min，無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，30℃無(wú)菌催芽，待西瓜胚根長(zhǎng)至0.5 cm時(shí)播于濕熱滅菌的土壤中，每盆1株西瓜苗，待幼苗長(zhǎng)至6~7片真葉時(shí)，接種40 mL貝萊斯芽胞桿菌菌株WB(6.25×106 CFU/mL)的菌懸液(WB處理)，以澆灌相同體積的無(wú)菌水為對(duì)照(CK)。
盆栽實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30盆。在接種菌株WB后4和6 d時(shí)采集西瓜功能葉片并分別命名為WB4和WB6，每個(gè)重復(fù)收集5株相同部位的功能葉片并混合作為1個(gè)樣品。將西瓜葉片立即用液氮冷凍并保存在-80℃冰箱中，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequenc‐ing,RNA-seq)分析。
1.2.5總RNA提取和轉(zhuǎn)錄組分析
使用TRIzol®試劑盒(植物RNA純化試劑盒,Invitrogen,美國(guó))從樣品中提取總RNA。使用2100生物分析儀(Agilent)和ND-2000(NanoDrop Tech‐nologies,美國(guó))分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。用高質(zhì)量的RNA樣品(OD260/OD280為1.8~2.2,RNA完整值(RNA integrity number,RIN)＞8)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。用Illumina(美國(guó))的TruSeqTM RNA樣品制備試劑盒構(gòu)建RNA-seq文庫(kù)。在Illumina2230HiSeq xten/NovaSeq 6000測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序(2×150 bp讀數(shù)長(zhǎng)度)。
使用SeqPrep修剪原始數(shù)據(jù)，并使用Sickle軟件對(duì)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制。西瓜栽培品種'97103'(Citrullus lanatus subsp.vulgaris)的基因組作為參考基因組。使用HISAT2軟件，在定向模式下將經(jīng)過(guò)濾處理后的有效片段數(shù)目分別與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。使用DESeq2、DEGseq和EdgeR對(duì)差異表達(dá)基因(differential gene expression,DEGs)進(jìn)行篩選。顯著差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)是差異倍數(shù)(fold change,FC)≥2或≤0.5和P-adjust＜0.05。使用基因本體論(GeneOntology,GO)和KEGG進(jìn)行注釋，并進(jìn)一步分析DEGs和通路表達(dá)量變化的原因。
轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)使用植物TF數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.gao-lab.org/)進(jìn)行鑒定。
1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證
為了驗(yàn)證RNA-seq的結(jié)果，從RNA-seq分析中選擇了4個(gè)DEGs，并進(jìn)行qRT-PCR分析以驗(yàn)證其表達(dá)變化。使用Revert Aid Premium逆轉(zhuǎn)錄酶(Thermo Scientific,美國(guó))將純化的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR分析在LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR儀器(Rotkreuz,瑞士)上進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系(10μL)：5μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，正、反向引物(10μmol/L)各0.2μL，1μL模板(cDNA)和3.6μL ddH2O。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)用于qRT-PCR的引物(表1)，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成；18S rRNA基因作為內(nèi)參基因。
qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變形3 min；95℃變性15 s，60℃30 s，45個(gè)循環(huán)；72℃1 min。使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因相對(duì)定量分析。每個(gè)測(cè)量重復(fù)3次。
1.2.7數(shù)據(jù)分析
使用SPSS 25.0軟件的Tukey's HSD檢驗(yàn)在P＜0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析。所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
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