2.結(jié)果與分析
2.1基本特性
2.1.1生長曲線
從圖1中可以觀察到細(xì)菌生長周期中的遲緩期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，6株芽孢桿菌的生長速率各不相同。在兩個培養(yǎng)溫度下，蠟樣芽孢桿菌（C）和沙福芽孢桿菌（D）生長速率較快，在培養(yǎng)第3 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期；而在20℃培養(yǎng)溫度下，地衣芽孢桿菌（J）生長速率較慢，第12 h左右才進(jìn)入對數(shù)期且OD值較低；在37℃培養(yǎng)溫度下，沙福芽孢桿菌（E）的生長速率較慢，24 h內(nèi)生長曲線上升緩慢。
圖1 20℃（A）和37℃（B）條件下6株芽孢桿菌的生長曲線（n=3）
蠟樣芽孢桿菌（C）的生長情況與前人研究結(jié)果一致，在37℃培養(yǎng)條件下，前2 h處于滯后期，在6 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。在LB培養(yǎng)基中測定吸光度發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌的生長速度比地衣芽孢桿菌更快，說明蠟樣芽孢桿菌有更強(qiáng)的生長能力，與本試驗(yàn)結(jié)論一致。
2.1.2產(chǎn)酸
本試驗(yàn)中以相同條件下空白組與菌株pH的差值體現(xiàn)菌株的產(chǎn)酸能力，表2與表3展示了在不同溫度下6株菌48 h內(nèi)的產(chǎn)酸情況。根據(jù)顯著性分析，在20℃下培養(yǎng)48 h，蠟樣芽孢桿菌（C）、高山芽孢桿菌（K）、沙福芽孢桿菌（E）和地衣芽孢桿菌（J）的pH變化顯著高于其他2株菌（P<0.05），其中蠟樣芽孢桿菌（C）和地衣芽孢桿菌（J）pH較空白組下降0.78；在37℃組中，培養(yǎng)至48 h的蠟樣芽孢桿菌（C）pH下降值仍顯著高于其他5株菌（P<0.05），為0.71。根據(jù)以上分析，蠟樣芽孢桿菌（C）的產(chǎn)酸能力顯著強(qiáng)于其他5株菌。
表2 20℃條件下6株菌產(chǎn)酸能力
表3 37℃條件下6株菌產(chǎn)酸能力
在不同溫度下6株芽孢桿菌的產(chǎn)酸能力順序并不完全一致，但總體來看，全部測試菌株都有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力；6株菌在生長過程中均會經(jīng)歷先產(chǎn)酸導(dǎo)致pH急劇下降，再回升保持pH在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)的過程。用與本試驗(yàn)相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，同樣發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌生長過程中培養(yǎng)基溶液的pH下降。在研究香腸發(fā)酵過程中pH的變化時得出相似的結(jié)果，他們分析認(rèn)為在細(xì)菌生長后期出現(xiàn)pH的波動可能是菌株內(nèi)的蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生了堿性的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)了培養(yǎng)基內(nèi)的酸堿值，從而保證細(xì)菌生長環(huán)境的相對穩(wěn)定。
2.1.3產(chǎn)氣
如圖2所示，所有菌株的Durham管內(nèi)均無氣柱產(chǎn)生；同時根據(jù)培養(yǎng)過程的觀察，可以確定6株芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中均沒有氣體產(chǎn)生。
2.2腐敗酶活性
芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶會使蛋白質(zhì)分解，引起食品的腐敗變質(zhì)。本試驗(yàn)采取液體法、乳粉瓊脂平板法、熟雞肉瓊脂平板法三種不同的方法測定蛋白酶活。三種方法底物各不相同，可綜合反映芽孢桿菌對于蛋白的腐敗能力。
2.2.1蛋白酶
圖3展示了6株芽孢桿菌的蛋白酶活力。液體法的反應(yīng)底物為酪蛋白，通過比較蛋白酶活性數(shù)值可以初步判斷6株菌的蛋白腐敗能力。解淀粉芽孢桿菌（G）表現(xiàn)出的活力最強(qiáng)，為7.17 U/mL，沙福芽孢桿菌（D）的蛋白酶活相比于其他菌較低，為0.75 U/mL，其余4株菌的蛋白酶活在2.16~3.32 U/mL之間。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以初步判定解淀粉芽孢桿菌（G）的蛋白腐敗能力最強(qiáng)。然而，液體法只能反映出6株芽孢桿菌對酪蛋白的分解能力。因此，在蛋白酶試驗(yàn)中，需要綜合液體法和平板培養(yǎng)的結(jié)果，以判斷不同菌株之間蛋白酶活力的差異。
圖4展示了培養(yǎng)到5 d不同菌株在20℃和37℃的溫度下在乳粉瓊脂平板上分解圈面積與菌落面積的比值，以菌株在乳粉瓊脂平板上的分解圈直徑大小可反映細(xì)菌分解蛋白能力的強(qiáng)弱。乳粉瓊脂平板法底物為脫脂乳粉，數(shù)據(jù)分析表明不同分離株的乳粉蛋白分解能力存在顯著性差異（P<0.05）。在20℃條件下，分解圈面積/菌落面積的比值最大的是解淀粉芽孢桿菌（G），為17.36，分解圈面積/菌落面積的比值由大至小依次為解淀粉芽孢桿菌（G）、高山芽孢桿菌（K）、沙福芽孢桿菌（D）、沙福芽孢桿菌（E）、蠟樣芽孢桿菌（C）。在37℃條件下，分解圈面積/菌落面積的比值最大的是高山芽孢桿菌（K），為9.64，分解圈面積/菌落面積的比值由大至小依次為高山芽孢桿菌（K）、解淀粉芽孢桿菌（G）、沙福芽孢桿菌（D）、沙福芽孢桿菌（E）、蠟樣芽孢桿菌（C）。通過比較分解圈面積與菌落面積的比值大小，可以對6株菌株的蛋白分解能力進(jìn)行排序。在乳粉瓊脂平板試驗(yàn)中，解淀粉芽孢桿菌（G）展現(xiàn)出較強(qiáng)的蛋白酶活性。發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌的蛋白分解能力較沙福芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌更強(qiáng)，并計(jì)算得出解淀粉芽孢桿菌的蛋白酶活力為2.55±0.02 U/mL。
CJA的主要營養(yǎng)成分為熟雞肉勻漿液，可以用于評估菌株對熟雞肉中蛋白質(zhì)的腐敗的能力。試驗(yàn)所用的6株芽孢桿菌在CJA上的分解圈產(chǎn)生情況如圖5所示。結(jié)果顯示，在適宜的生長溫度37℃下，經(jīng)過10 d培養(yǎng)，所有接種至CJA的芽孢桿菌均未產(chǎn)生分解圈。通過計(jì)算，本試驗(yàn)中CJA的熟雞肉添加量為12.5 mg/mL。而雞肉煮制之后，營養(yǎng)物質(zhì)會大量流失，因此僅以熟雞胸肉為營養(yǎng)源制備的CJA平板中可供芽孢桿菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)含量低，僅可維持菌落生長卻無明顯分解圈產(chǎn)生。
圖5 CJA分解圈
2.2.2脂肪酶
6株菌株在芽孢桿菌較適宜的生長溫度37℃條件下培養(yǎng)48 h后全部呈陽性（圖6），說明6株芽孢桿菌可產(chǎn)脂肪酶，具有脂肪腐敗能力。芽孢桿菌作為一種常見的胞外脂肪酶來源，部分分離株已被證明具有很強(qiáng)的脂肪酶活力，并用于處理食品工業(yè)中富含脂肪的廢棄物。先前的多項(xiàng)研究證明蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和高山芽孢桿菌具有脂肪酶活力，與本試驗(yàn)結(jié)論一致。
圖6脂肪酶試驗(yàn)結(jié)果
2.2.3淀粉酶
圖7展示了在20℃和37℃條件下培養(yǎng)5 d后，6株芽孢桿菌產(chǎn)生的最大分解圈面積數(shù)據(jù)。芽孢桿菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的優(yōu)勢微生物，常見于各種淀粉含量高的食品。SHEN等的研究證明芽孢桿菌具有較強(qiáng)的淀粉分解能力。在本試驗(yàn)的6株芽孢桿菌中，蠟樣芽孢桿菌（C）、沙福芽孢桿菌（D）、高山芽孢桿菌（K）、解淀粉芽孢桿菌（G）和地衣芽孢桿菌（J）這5株芽孢桿菌展示出了淀粉分解能力。在20℃條件下，解淀粉芽孢桿菌（G）的分解圈面積最大，達(dá)到了2.30 cm2，說明在20℃的環(huán)境溫度下，5株產(chǎn)淀粉酶的菌株中解淀粉芽孢桿菌（G）的淀粉酶活力最強(qiáng)；在37℃條件下，解淀粉芽孢桿菌（G）和地衣芽孢桿菌（J）的分解圈面積顯著大于另外3株（P<0.05），解淀粉芽孢桿菌（G）的分解圈面積達(dá)到了16.53 cm2，地衣芽孢桿菌（J）的分解圈面積達(dá)到了16.61 cm2，說明在37℃的環(huán)境溫度下，5株產(chǎn)淀粉酶的菌株中解淀粉芽孢桿菌（G）、地衣芽孢桿菌（J）的淀粉酶活力最強(qiáng)。
綜合6株菌在兩個溫度下表現(xiàn)出的淀粉酶活力，6株菌株的淀粉分解能力最強(qiáng)的是解淀粉芽孢桿菌（G）。通過探究酒曲中不同芽孢桿菌的酶解能力，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的葡萄糖淀粉酶活力高于蠟樣芽孢桿菌，這與本試驗(yàn)結(jié)論一致。研究指出，解淀粉芽孢桿菌比蠟樣芽孢桿菌等擁有更多的胞外淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，因此具有更強(qiáng)的淀粉分解能力。
3.結(jié)論
在基本特性試驗(yàn)中，蠟樣芽孢桿菌（C）和沙福芽孢桿菌（D）表現(xiàn)出較快的生長速率，在培養(yǎng)的第3 h進(jìn)入對數(shù)生長期。蠟樣芽孢桿菌（C）展現(xiàn)了較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，在20℃和37℃條件下，與空白組相比pH的下降值分別為0.78和0.71；大部分菌株都展現(xiàn)出了蛋白和淀粉腐敗能力，其中解淀粉芽孢桿菌（G）的綜合腐敗能力最強(qiáng)，具體體現(xiàn)為蛋白酶活力為7.17 U/mL，蛋白酶分解圈面積/菌落面積比值和淀粉酶分解圈面積顯著高于其他菌株（P<0.05）。
綜合試驗(yàn)結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)6株從腐敗低溫肉制品分離出的芽孢桿菌具有腐敗異質(zhì)性，體現(xiàn)出的生長速率、產(chǎn)酸、蛋白酶活力、淀粉酶活力等均不相同。而不同的理化特性對應(yīng)不同的防治方法，后續(xù)研究中將深入探究芽孢桿菌的腐敗機(jī)理，并研發(fā)更有針對性、更高效的芽孢桿菌控制方法，為提升肉制品安全提供保障。
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