1材料與方法
1.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)
試驗(yàn)于2015年6月至2017年7月在中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所完成。
1.2試驗(yàn)材料
1.2.1毒株和細(xì)胞DEV參考強(qiáng)毒株（CVCCAV1221）由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存；SPF鴨胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。
1.2.2試驗(yàn)動(dòng)物6周齡易感麻鴨（中和抗體＜1﹕4）購(gòu)自北京昌平某鴨場(chǎng)。
1.2.3質(zhì)粒和菌株含有紅色熒光蛋白R(shí)FP基因的載體pT-RFP由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測(cè)室構(gòu)建保存；pMD18T-Simple載體購(gòu)自大連TaKaRa公司，DH5α受體菌購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2.4主要試劑Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清、M199培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司；OPTI-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司；無內(nèi)毒素高純質(zhì)粒提取試劑盒Endo-free Plasmid Mini Kit II購(gòu)自O(shè)mega公司。
表1目的基因的擴(kuò)增引物及鑒定引物
1.2.5引物試驗(yàn)所用PCR引物見表1，由上海Invitrogen生物公司合成。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)進(jìn)行。
1.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-UL56-RFP構(gòu)建策略見圖1。以提取的DEV基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增UL56基因上下游兩端同源臂UL56-u、UL56-d。將兩同源臂片段克隆到pMD18T-Simple載體，獲得重組質(zhì)粒pT-UL56ud。將重組質(zhì)粒pT-UL56ud用I酶切，電泳回收去磷酸化后，與用I酶切的pT-RFP連接，將RFP表達(dá)盒插入到pT-UL56ud中，獲得重組質(zhì)粒pT-UL56-RFP。按Endo-free plasmid mini kit II說明書提取高純度質(zhì)粒備用。
a：DEV基因組示意圖，包括UL,IRS,US和TRS區(qū)域；b：PCR擴(kuò)增UL56基因的上下游片段UL56-u，UL56-d；c：DEVΔ3513-RFP的構(gòu)建，將RFP基因表達(dá)盒插入到DEV UL56基因組；d:應(yīng)用融合PCR從DEV親本毒中擴(kuò)增UL56-ud。PCR產(chǎn)物與DEVΔ3513-RFP進(jìn)行同源重組，獲得重組病毒DEVΔ3513；e:應(yīng)用PCR從DEV親本毒中擴(kuò)增UL56u-3 513 bp-UL56d。PCR產(chǎn)物與DEVΔ3513-RFP進(jìn)行同源重組，獲得重組病毒DEVΔ3513(R)
1.3.3重組病毒DEVΔ3513-RFP的構(gòu)建DEV接種DEF（MOI=0.1），吸附1—2 h后，按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染高純質(zhì)粒pT-UL56-RFP。按文獻(xiàn)進(jìn)行蝕斑純化。
1.3.4重組病毒DEVΔ3513的構(gòu)建以DEV基因組DNA為模板，用引物UL56-uF、Overlap-R以及Overlap-F、UL56-dR進(jìn)行融合PCR。純化的PCR產(chǎn)物與重組病毒DEVΔ3513-RFP共轉(zhuǎn)染。
1.3.5重組病毒DEVΔ3513(R)的構(gòu)建以DEV基因組DNA為模板，用引物UL56-uF、UL56-dR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。純化的PCR產(chǎn)物與重組病毒DEVΔ3513-RFP共轉(zhuǎn)染。
1.3.6一步生長(zhǎng)曲線將重組病毒及其親本病毒分別接種25cm2的細(xì)胞瓶中（moi=0.01），接種后每隔12h取出1瓶接毒細(xì)胞，測(cè)量其病毒含量，繪制一步生長(zhǎng)曲線。
1.3.7蝕斑大小分析將重組病毒及其親本病毒分別作適當(dāng)稀釋，接種已長(zhǎng)成單層DEF，加入M199營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖覆蓋，培養(yǎng)5—7 d。隨機(jī)選取20個(gè)蝕斑，應(yīng)用CellSens v1.6軟件（Olympus Company，Japan）對(duì)蝕斑面積進(jìn)行測(cè)量。
1.3.8致病性試驗(yàn)將20只6周齡易感麻鴨，隨機(jī)分成4組，每組5只。第1組肌肉注射DEVΔ3513，每只105.0TCID50；第2組肌肉注射DEVΔ3513(R)，每只105.0TCID50；第3組肌肉注射DEV親本毒，每只105.0TCID50；第4組注射生理鹽水，作對(duì)照。每組單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，觀察10 d，每天記錄發(fā)病死亡情況。試驗(yàn)結(jié)束后剖檢所有存活鴨。對(duì)全部動(dòng)物取肝臟組織，固定于4%多聚甲醛溶液，按常規(guī)程序制備病理切片并進(jìn)行H.E.染色。
1.3.9免疫原性測(cè)定將15只6周齡易感麻鴨，隨機(jī)分成3組，每組5只。第1組肌肉注射DEVΔ3513，每只103.0TCID50；第2組肌肉注射鴨瘟活疫苗種毒（CVCC AV1222），每只103.0TCID50；第3組注射生理鹽水，作對(duì)照。每組單獨(dú)隔離飼養(yǎng)。在免疫后14天，腿部肌肉注射接種DEV強(qiáng)毒（CVCC AV1221），每只103.0MLD。觀察10 d，每天記錄發(fā)病死亡情況。
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