2結(jié)果
2.1重組質(zhì)粒pUC19-△BspE的構(gòu)建及鑒定
以牛種布魯氏菌A19菌液作為模板，利用PCR反應(yīng)對(duì)BspE基因上、下游同源臂進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，獲得大小均為601bp的特異性條帶(圖2A)，與預(yù)期相符;將BspE基因上、下游同源臂按1:1混合后，使用融合PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，融合片段大小為1202bp(圖2B)，與預(yù)期相符;將融合片段與pUC19-SacB載體連接，得到重組質(zhì)粒pUC19-△BspE，經(jīng)PCR檢測(cè)獲得大小為1202 bp的特異性條帶(圖2C)，測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，可用于后續(xù)篩選BspE基因缺失株。
圖2重組質(zhì)粒pUC19-ABspE的構(gòu)建及鑒定
2.2重組質(zhì)粒pBB-BspE的構(gòu)建及鑒定
以牛種布魯氏菌A19菌液、pET-28a(+)和pBBR1MCS作為模板，分別對(duì)BspE、kana基因及pBB復(fù)制子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，分別獲得大小為675、1229和1741bp的特異性條帶(圖3A~3C)，與預(yù)期相符;將BspE基因片段與kana基因片段按1:1比例混合后，使用融合PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，融合片段大小為1904 bp(圖3D)，與預(yù)期相符;將融合片段與pBB復(fù)制子片段連接，得到重組質(zhì)粒pBB-BspE，經(jīng)PCR檢測(cè)獲得大小為675bp的特異性條帶(圖3E)，經(jīng)測(cè)序鑒定其與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，可用于后續(xù)篩選BspE基因回補(bǔ)株。
圖3重組質(zhì)粒pBB-BspE的構(gòu)建及鑒定
2.3布魯氏菌BspE基因缺失株篩選
選擇陽性菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，在樣品5和7中擴(kuò)增出大小為2060bp的特異性條帶(圖4)，與預(yù)期相符，表明BspE基因缺失株A19ΔBspE構(gòu)建成功。
圖4牛種布魯氏菌BspE基因缺失株篩選
2.4布魯氏菌BspE基因回補(bǔ)株篩選
選擇陽性菌落進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示，檢測(cè)到大小約為14.59ku的BspE-flag條帶(圖5)，表明BspE基因回補(bǔ)株A19C△BspE構(gòu)建成功。
圖5牛種布魯氏菌BspE基因回補(bǔ)株篩選
2.5 BspE基因缺失對(duì)布魯氏菌體外生長的影響
細(xì)菌生長曲線測(cè)定結(jié)果顯示，與牛種布魯氏菌A19和A19C△BspE相比，在24~40h測(cè)定時(shí)間內(nèi)，A19△BspE呈上升趨勢(shì)，56h后下降，但三者之間的生長變化并無顯著差異(P>0.05);與牛種布魯氏菌A19和A19△BspE相比，在40~56h測(cè)定時(shí)間內(nèi)，A19C△BspE呈下降趨勢(shì)，56h后上升，但三者之間的生長變化并沒有顯著差異(P>0.05);在所有測(cè)定的時(shí)間內(nèi)，牛種布魯氏菌A19、A19△BspE與A19C△BspE的生長趨勢(shì)均沒有顯著差異(P>0.05，圖6)，說明BspE基因的敲除對(duì)布魯氏菌的體外生長沒有影響。
2.6 BspE基因缺失對(duì)布魯氏菌胞內(nèi)生存的影響
由圖7可知，與牛種布魯氏菌A19和A19C△BspE相比，在感染6和48h后，A19△BspE在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)生存能力呈下降趨勢(shì)，但三者之間的胞內(nèi)生存能力并無顯著差異(P>0.05)，均在8h達(dá)對(duì)數(shù)生長期，32h進(jìn)入平臺(tái)期;在感染0、6、12、24及48h后，A19△BspE與牛種布魯氏菌A19、A19C△BspE的胞內(nèi)生存能力均無顯著差異(P>0.05)，說明BspE基因的缺失對(duì)布魯氏菌在胞內(nèi)的存活情況沒有影響。
2.7 BspE基因缺失對(duì)布魯氏菌黏附能力的影響
細(xì)菌黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，與牛種布魯氏菌A19和A19C△BspE相比，A19△BspE對(duì)RAW264.7細(xì)胞的黏附能力沒有顯著差異(P>0.05，圖8)，說明BspE基因的敲除對(duì)布魯氏菌在胞內(nèi)的黏附能力沒有影響。
圖8牛種布魯氏菌A19、A19ΔBspE和A19CΔBspE的黏附能力
2.8 BspE基因缺失對(duì)布魯氏菌入侵RAW264.7細(xì)胞能力的影響
細(xì)菌入侵試驗(yàn)結(jié)果顯示，與牛種布魯氏菌A19和A19C△BspE相比，A19△BspE人侵RAW264.7細(xì)胞的能力沒有顯著差異(P>0.05，圖9)，說明BspE基因的敲除對(duì)布魯氏菌入侵細(xì)胞的能力沒有影響。
2.9效應(yīng)蛋白BspE在小鼠RAW264.7細(xì)胞中的定位
由圖10可知，在未感染的MOCK組中并沒有出現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光;牛種布魯氏菌A19感染組中只出現(xiàn)了紅色熒光，沒有出現(xiàn)綠色熒光;帶flag標(biāo)簽的BspE蛋白的A19C△BspE感染組中出現(xiàn)了紅色熒光和綠色熒光(箭頭所示)，且效應(yīng)蛋白BspE大多分布于核周區(qū)域，表明效應(yīng)蛋白BspE主要定位于感染細(xì)胞的核周區(qū)域。
3討論
布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陰性細(xì)菌，缺乏典型的外毒素、莢膜等毒力因子。布魯氏菌毒力因子有助于細(xì)菌躲避機(jī)體免疫殺傷，從而侵入宿主細(xì)胞，完成胞內(nèi)增殖并釋放至胞外造成疾病。T4SS是布魯氏菌重要的毒力因子，其可調(diào)節(jié)細(xì)菌效應(yīng)蛋白，并轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞，有利于布魯氏菌感染宿主細(xì)胞。
本研究利用同源重組結(jié)合SacB反向篩選技術(shù)成功獲得了無痕缺失的牛種布魯氏菌A19效應(yīng)蛋白BspE基因缺失株A19△BspE。王玉飛等利用含蔗糖致死基因SacB的pEX18Gm質(zhì)粒成功構(gòu)建了缺失T4SS啟動(dòng)子區(qū)的羊種布魯氏菌無痕敲除株。Tian等以SacB為負(fù)篩選標(biāo)記，成功敲除了鴨疫里默氏桿菌CH-1的dps基因。
生長曲線結(jié)果顯示，在所有測(cè)定的時(shí)間內(nèi)，牛種布魯氏菌A19、A19△BspE與A19C△BspE的生長趨勢(shì)均沒有顯著差異，表明BspE基因的敲除不會(huì)影響布魯氏菌的生長。這與以往研究者發(fā)現(xiàn)布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白VceA、VceC、BPE043及BPE159等不影響布魯氏菌的體外生長結(jié)果一致。
布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖主要是在感染后24~48h。本研究比較了牛種布魯氏菌A19、A19△BspE、A19C△BspE在小鼠RAW264.7細(xì)胞中的生存能力。結(jié)果顯示，A19△BspE與牛種布魯氏菌A19、A19C△BspE在RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力均沒有顯著差異，表明BspE基因的缺失不會(huì)影響布魯氏菌在胞內(nèi)的存活情況。這與徐朕宇等研究發(fā)現(xiàn)缺失牛種布魯氏菌疫苗株A19效應(yīng)子BtpA基因后不影響布魯氏菌在小鼠RAW264.7細(xì)胞中的生存結(jié)論基本一致。
黏附對(duì)布魯氏菌感染宿主細(xì)胞極為重要。本研究對(duì)牛種布魯氏菌A19、A19△BspE、A19C△BspE黏附入侵RAW264.7細(xì)胞的能力進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，A19△BspE黏附和入侵RAW264.7細(xì)胞的能力與牛種布魯氏菌A19、A19C△BspE均沒有顯著差異，表明BspE基因的缺失不影響布魯氏菌黏附、入侵RAW264.7細(xì)胞的能力。這與鄧肖玉等、陳蕾等發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌A19 virB啟動(dòng)子缺失和豬種布魯氏菌S2入侵相關(guān)基因ialB缺失后不影響布魯氏菌對(duì)RAW264.7細(xì)胞的黏附入侵能力的結(jié)論基本一致。上述結(jié)果表明布魯氏菌的BspE可能在體外培養(yǎng)及體外感染細(xì)胞的過程中并不發(fā)揮對(duì)細(xì)菌黏附、入侵及胞內(nèi)生存的調(diào)控作用，其重要的生物學(xué)功能需進(jìn)一步探究。
IFA結(jié)果顯示，在感染24h后，BspE主要分布于核周區(qū)域。Myeni等在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HA-BspE表達(dá)質(zhì)粒后，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察其主要在核周區(qū)域形成離散的囊泡，而本研究在構(gòu)建的缺失菌株A19△BspE上回補(bǔ)BspE質(zhì)粒，在菌體上進(jìn)一步證實(shí)了BspE主要定位于感染細(xì)胞的核周區(qū)域。
綜上所述，效應(yīng)蛋白BspE的缺失不影響布魯氏菌在RAW264.7細(xì)胞中的生存及黏附入侵細(xì)胞的能力，其在布魯氏菌感染過程中的具體作用尚需進(jìn)一步探究。由于BspE的缺失并不影響布魯氏菌在體外及細(xì)胞感染過程中的生長，提示可針對(duì)BspE功能位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記疫苗或鑒別診斷類產(chǎn)品的開發(fā)。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究布魯氏菌效應(yīng)蛋白BspE的生物學(xué)功能及致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
4結(jié)論
本研究通過構(gòu)建牛種布魯氏菌效應(yīng)蛋白BspE基因缺失株和回補(bǔ)株，發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白BspE的缺失不影響布魯氏菌在體外以及RAW264.7細(xì)胞中的生存、黏附、入侵能力，且效應(yīng)蛋白BspE主要定位在感染細(xì)胞的核周區(qū)域。
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