2.4病毒拯救
收獲轉(zhuǎn)染后的病毒接種至新的BHK-21細(xì)胞，48 h后反復(fù)凍融細(xì)胞，收獲F1代病毒。將F1代病毒連續(xù)盲傳至F3代，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果（圖4）顯示，出現(xiàn)典型的CPE，細(xì)胞收縮變圓，有的開(kāi)始脫落，而對(duì)照細(xì)胞無(wú)變化。將拯救病毒命名為rSVA。
圖4病毒拯救顯微鏡觀察結(jié)果
2.5拯救病毒鑒定
F5代rSVA分節(jié)段PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖5）顯示，成功擴(kuò)增出預(yù)期大小的SVA全基因組序列的7個(gè)片段。經(jīng)測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與親本毒株高度同源。
圖5拯救病毒分節(jié)段PCR鑒定結(jié)果
2.6生長(zhǎng)曲線分析
為比較拯救病毒與親本病毒的復(fù)制能力與增殖特性，繪制病毒生長(zhǎng)曲線（圖6），發(fā)現(xiàn)兩種病毒的復(fù)制能力與增殖特性相似，無(wú)明顯差異。
圖6 rSVA與親本病毒生長(zhǎng)曲線
2.7間接免疫熒光試驗(yàn)
對(duì)親本病毒與拯救病毒進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果（圖7）顯示：感染BHK-21細(xì)胞18 h后，親本病毒與拯救病毒在熒光顯微鏡下均能顯示出特異性的綠色熒光，而對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有綠色熒光產(chǎn)生。
圖7間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果
2.8噬斑形成試驗(yàn)
接種至BHK-21細(xì)胞后，rSVA與親本病毒均能產(chǎn)生明顯的噬斑（圖8），且噬斑大小及形態(tài)基本一致，表明拯救病毒與親本病毒具有相似的噬斑形成能力。
圖8噬斑試驗(yàn)結(jié)果
3討論
SVA最初從被污染的PER.C6細(xì)胞系中分離得到。污染物被認(rèn)為源自胎牛血清或豬胰蛋白酶，早期作為溶瘤病毒而受到關(guān)注。2015年SVA在廣東省某豬場(chǎng)首次被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，隨后逐漸蔓延至我國(guó)多個(gè)省份。SVA可引起與FMD等水泡病類似的臨床癥狀并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，近年來(lái)SVA在我國(guó)流行分布較廣泛，其診斷目前主要依賴于病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)，在防控方面尚未開(kāi)發(fā)出商業(yè)化疫苗。
反向遺傳操作技術(shù)在反轉(zhuǎn)錄病毒的分子特性研究中是一項(xiàng)重要工具，為RNA病毒在遺傳特性、疫苗構(gòu)建等方面奠定了重要基礎(chǔ)。為快速構(gòu)建SVA感染性克隆平臺(tái)，本試驗(yàn)采用快速一步法，即將SVA全長(zhǎng)基因組序列一次擴(kuò)增，并與設(shè)計(jì)的CMV啟動(dòng)子、poly（A）+HDVr基因相連接，同時(shí)基因上的同源臂保證3段基因能夠依次插入線性化的低拷貝質(zhì)粒中。在同源重組酶催化下，37℃反應(yīng)30 min即可一步完成同源重組結(jié)合，實(shí)現(xiàn)體外環(huán)化，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pWSK-29-SVA直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定，質(zhì)粒構(gòu)建正確。
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，第1代病變不明顯，在盲傳3代后可出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、脫落，初步表明病毒拯救成功。本研究在盲傳至第5代時(shí)進(jìn)行病毒拯救鑒定，此時(shí)能夠降低感染性克隆質(zhì)粒干擾，同時(shí)使用含有去除DNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒可以清除殘存質(zhì)粒。通過(guò)RT-PCR方法分7段擴(kuò)增病毒基因，并分別對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行正反兩向測(cè)序，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與親本毒株一致。為研究拯救毒株與親本毒株生物學(xué)特性的差異，本試驗(yàn)比較了F5 rSVA與親本第5代SVA的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線，結(jié)果表明拯救毒株與親本毒株生長(zhǎng)動(dòng)力曲線基本一致。噬斑形成試驗(yàn)顯示，拯救毒株與親本毒株產(chǎn)生噬斑大小、形狀基本一致，表明一步法構(gòu)建SVA感染性克隆平臺(tái)準(zhǔn)確有效。
病毒感染性克隆的關(guān)鍵在于全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建，SVA基因組長(zhǎng)度較短（約7.3 kb），為單股正鏈RNA。本研究在構(gòu)建感染性克隆過(guò)程中使用高保真DNA聚合酶，這樣能夠高效擴(kuò)增基因組，并且可有效避免出現(xiàn)突變。但當(dāng)片段長(zhǎng)度大于5 kb時(shí)聚合酶的錯(cuò)誤率呈指數(shù)級(jí)上升，因此對(duì)于較長(zhǎng)的基因組，若擔(dān)心長(zhǎng)片段擴(kuò)增導(dǎo)致保真度降低，可將病毒基因組分成多節(jié)段進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)計(jì)好同源臂并確保連接正確，這樣也可實(shí)現(xiàn)快速質(zhì)粒構(gòu)建。
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