2結(jié)果
2.1大腸桿菌噬菌體的分離鑒定
2.1.1噬菌體的分離及噬菌斑特征
尿液樣品經(jīng)過(guò)濾后的上清液與大腸桿菌K-12指示劑MC1061混合，通過(guò)雙層瓊脂平板法鑒定噬菌斑并純化，37℃培養(yǎng)8 h，在平板上可見(jiàn)圓形、邊緣光滑整齊的噬菌斑，中等大小且透明，如圖1所示。
圖1噬菌體vB_EcoS_JA2噬菌斑形態(tài)特征
2.1.2噬菌體的電鏡觀察
純化的噬菌體經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后，在透射電鏡下所觀察到的形態(tài)如圖2所示。噬菌體vB_EcoS_JA2可見(jiàn)六角形頭部，頭部直徑約40 nm，噬菌體含可收縮性尾部，寬約5 nm、長(zhǎng)約110 nm。根據(jù)2012年國(guó)際病毒分類委員會(huì)第9次報(bào)告提出的噬菌體分類與命名標(biāo)準(zhǔn)，該噬菌體符合有尾噬菌體目（）、長(zhǎng)尾噬菌體科（）特征。
圖2噬菌體JA2電鏡形態(tài)
2.1.3噬菌體核酸類型鑒定
經(jīng)DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease處理后，將噬菌體基因組進(jìn)行核酸電泳鑒定，結(jié)果顯示，噬菌體JA2的基因組能被DNase I完全降解，而用RNase A處理不降解，表明其基因組核酸為DNA（圖3）。同時(shí)Mung Bean Nuclease處理亦無(wú)法降解，表明該噬菌體基因組為雙鏈DNA(dsDNA)。
圖3噬菌體JA2核酸類型鑒定
2.1.4噬菌體的裂菌譜
通過(guò)平板裂解實(shí)驗(yàn)及點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)（Spot Test Assay）檢測(cè)噬菌體對(duì)不同細(xì)菌的裂解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JA2對(duì)大腸桿菌K-12菌株MC1061，MG1655和DM1187具有極強(qiáng)的裂解效果，形成明顯的裂菌圈，裂菌圈直徑＞20 mm。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該噬菌體對(duì)臨床分離的UPEC菌株U892、U4208、U4228以及銅綠假單胞菌株U955也有較強(qiáng)的裂菌能力，對(duì)大腸桿菌O157菌株Min27，部分UPEC分離株，金黃色葡萄球菌，陰溝腸桿菌等沒(méi)有明顯的裂解效果（表1）。
表1噬菌體JA2裂菌譜
菌株類型菌株裂菌活性大腸桿菌K-12菌株E.coli K-12 strainMC1061+++MG1655+++DM1187+++UPEC分離株UPEC isolatesU892++U4208++U4228++U4261-U899-U3486-大腸桿菌O157菌株E.coli O157 isolateMin27-銅綠假單胞菌分離株P(guān).aeruginosa isolateIsolates of enterobacter cloacaeStaphylococcus aureusU955+陰溝腸桿菌分離株Enterobacter cloacae isolateU547-金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus strainATCC43300-
表注：+++：極強(qiáng)裂解性；++：強(qiáng)裂解性；+：弱裂解性；-：不裂解.
2.2大腸桿菌噬菌體的生物學(xué)特性
2.2.1噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)
分別將噬菌體JA2與指示菌MC1061按照不同的比例混合，培養(yǎng)8 h后，測(cè)定培養(yǎng)上清中的噬菌體滴度（表2）。結(jié)果表明，當(dāng)MOI=0.1時(shí)，培養(yǎng)后噬菌體滴度最高，表明0.1是該噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)。
表2噬菌體JA2最佳MOI測(cè)定
編號(hào)細(xì)菌數(shù)（CFU/mL）噬菌體數(shù)（PFU/mL）感染復(fù)數(shù)8h噬菌體滴度（PFU/mL）11×1091×1060.0012.50×108 21×1091×1070.016.34×1010 31×1091×1080.12.15×1012 41×1091×10914.45×1011 51×1081×109108.56×1010 61×1071×1091007.37×109
2.2.2噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線
如圖4所示，噬菌體JA2感染宿主菌后10 min內(nèi)噬菌體滴度沒(méi)有明顯變化，表明其潛伏期約為10 min，感染后20～60 min內(nèi)噬菌體的滴度明顯上升，之后趨于穩(wěn)定，表明噬菌體裂解期約為60 min。根據(jù)裂解量（Burst Size）=爆發(fā)末期噬菌體效價(jià)（PFU/ml）/感染初期宿主菌濃度（CFU/mL）計(jì)算，噬菌體裂解量約為117 PFU/Cell，表明該噬菌體具有極強(qiáng)的裂解和復(fù)制能力。
圖4噬菌體JA2的一步生長(zhǎng)曲線
2.2.3噬菌體的熱穩(wěn)定性
噬菌體JA2在40～80℃水浴中分別作用30 min后的效價(jià)變化情況如圖5所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，噬菌體效價(jià)開(kāi)始明顯下降，溫度到達(dá)80℃時(shí)噬菌體基本失活。表明該噬菌體具有一定的耐熱性，但高溫容易引起其失活。
圖5噬菌體JA2的熱穩(wěn)定性
2.2.4噬菌體的pH穩(wěn)定性
在不同pH條件下培養(yǎng)1 h后，噬菌體在pH6.0～10.0范圍能保持較高的活性，噬菌體滴度沒(méi)有明顯變化，且在pH為7時(shí)，噬菌體效價(jià)最高。隨著pH值的升高或降低，噬菌體的滴度下降明顯，在pH為2和13時(shí)，噬菌體完全失活（圖6）。該結(jié)果表明該噬菌體能耐受弱酸和弱堿條件，具有較好的酸堿耐受性。
圖6噬菌體JA2的pH穩(wěn)定性
2.2.5噬菌體對(duì)氯仿的敏感性
將噬菌體JA2與分別與含1%，2%，5%氯仿的LB培養(yǎng)基混合，處理30 min后通過(guò)雙層瓊脂平板法檢測(cè)噬菌體效價(jià)。結(jié)果顯示，氯仿對(duì)噬菌體的滴度有較為明顯的影響，隨著氯仿濃度升高，噬菌體存活率相應(yīng)降低（圖7），提示該噬菌體對(duì)氯仿敏感。
圖7噬菌體JA2對(duì)氯仿的敏感性
2.2.6噬菌體JA2對(duì)紫外線的敏感性
噬菌體經(jīng)紫外照射后，按15 min為時(shí)間間隔取樣，噬菌體滴度急劇下降，隨著照射時(shí)間延長(zhǎng)，噬菌體滴度下降幅度平緩（圖8），表明該噬菌體對(duì)紫外線較為敏感，但也具有一定的抵抗能力。
圖8噬菌體JA2對(duì)紫外線的敏感性
3討論
本研究從臨床尿路感染病例的尿液樣品中分離得到了1株大腸桿菌噬菌體，根據(jù)其形態(tài)特征和生物學(xué)特性，將其命名為vB_EcoS_JA2，其中vB：viruses Bacteriophage（病毒噬菌體）；Eco：（大腸桿菌）；S：（長(zhǎng)尾噬菌體科），JA2為分離噬菌體的編號(hào)。對(duì)噬菌體JA2的初步鑒定和生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示，該噬菌體在平板上形成的噬菌斑邊緣整齊且清晰。噬菌體JA2對(duì)大腸桿菌K-12菌株、UPEC分離株具有明顯的裂菌效果。噬菌體JA2在40～60℃具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)紫外線具有一定的抵抗力，其最佳感染復(fù)數(shù)為0.1。同時(shí)，該噬菌體一步生長(zhǎng)曲線顯示，其潛伏期約為10 min，爆發(fā)期約為60 min，裂解量約為124 PFU/Cell，表明JA2噬菌體具有極強(qiáng)的裂解和復(fù)制能力。
目前，大量的抗生素使用甚至濫用，這是導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌頻發(fā)、“超級(jí)細(xì)菌”產(chǎn)生的元兇。廣譜抗生素濫用導(dǎo)致的正常菌群損傷、細(xì)菌耐藥性問(wèn)題對(duì)公共衛(wèi)生安全危害極大。耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，極大的增加了細(xì)菌感染性疾病，尤其是尿路致病性大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌感染的治療難度。此外，UPEC臨床菌株不斷增強(qiáng)的抗生素耐藥性，尤其是近來(lái)出現(xiàn)的對(duì)碳青霉烯類和粘菌素類抗生素的耐藥性，使得UTI成為抗生素耐藥的又一重災(zāi)區(qū)，迫切需要尋找新的治療和預(yù)防手段加以防控。為此，探索不易引起耐藥和殘留的噬菌體抗菌治療（Phage therapy）策略成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。
裂解性噬菌體是特異性感染并殺滅細(xì)菌的病毒，其具有殺菌效率高、副作用少、宿主譜窄等特點(diǎn)，不會(huì)破壞機(jī)體正常菌群，在抗細(xì)菌感染中具有巨大潛力，因此在細(xì)菌耐藥形勢(shì)日益嚴(yán)峻的今日，開(kāi)發(fā)噬菌體抗菌制劑已引發(fā)全球關(guān)注。2018年8月，上海噬菌體與耐藥研究所噬菌體治療團(tuán)隊(duì)成功完成了一例針對(duì)復(fù)雜性、反復(fù)性多重耐藥肺炎克雷伯菌尿路感染患者的治療，展示了噬菌體在治療多重耐藥菌感染、復(fù)發(fā)性尿路感染的強(qiáng)大潛力。本研究從尿液樣品中分離的噬菌體JA2，UPEC臨床分離株具有很好的裂解能力，且具有較好的穩(wěn)定性，它是研究治療耐藥性細(xì)菌尿路感染的良好實(shí)驗(yàn)材料。
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