摘要以東北玉米主產(chǎn)區(qū)玉米莖腐病的主要病原菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）為研究對象，采用十字交叉法、干重法、生物學檢測法以及熒光免疫定量分析等研究方法，研究不同穩(wěn)定性有機磷源卵磷脂和植酸對禾谷鐮刀菌菌絲生長和致病力的影響。結(jié)果表明：卵磷脂能顯著促進禾谷鐮刀菌生長，平板培養(yǎng)試驗中，磷濃度為4.38 mmol/L時，卵磷脂組在生長第6天菌落直徑可達8.5 cm，而植酸組與K2HPO4組在培養(yǎng)第7天菌落直徑還未達到7 cm，生物量測定結(jié)果與之相符；不同有機磷不僅影響禾谷鐮刀菌的生長，還影響其代謝，磷濃度為43.8 mmol/L時，卵磷脂、植酸發(fā)酵培養(yǎng)液對玉米種子的萌發(fā)抑制率分別為56.7%和43.3%，分別為K2HPO4的3.4倍和2.6倍，發(fā)酵培養(yǎng)液中抑制玉米種子生長的物質(zhì)是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），其中卵磷脂組DON質(zhì)量濃度最高，為978.55μg/L，植酸次之，為580.79μg/L，二者顯著高于K2HPO4（104.51μg/L），且DON質(zhì)量濃度隨著磷濃度的增加而升高；利用有機磷產(chǎn)生DON毒素是禾谷鐮刀菌侵染玉米導致玉米莖腐病發(fā)生的主要致病機制，根據(jù)DON測定結(jié)果設(shè)置致病力試驗，結(jié)果表明，以卵磷脂、植酸為磷源時，玉米苗期的發(fā)病率分別為98.33%和90.00%，病情指數(shù)分別為94和89，與K2HPO4（發(fā)病率76.66%，病情指數(shù)72）相比禾谷鐮刀菌致病力顯著提升。此外，還討論了土壤有機磷生物有效性及其影響因素對玉米莖腐病發(fā)生的影響。
禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是東北玉米主產(chǎn)區(qū)玉米莖腐病的主要致病菌。玉米莖腐病又稱莖基腐病或青枯病，是典型的土壤傳播病害。一般年份的發(fā)病率15%~20%，減產(chǎn)約20%，嚴重時發(fā)病率可達70%以上，產(chǎn)量損失約50%，已成為限制我國糧食產(chǎn)量的重要因素之一。不同學者從植物病理學的角度對該病原菌的種類、侵染規(guī)律、致病機理以及防治技術(shù)等進行了廣泛而深入的研究，但近年來，隨著玉米重茬面積不斷增加，秸稈還田、免耕播種和密植技術(shù)的推廣應(yīng)用，玉米莖腐病的發(fā)病情況逐年加重。本研究對土壤主要有機磷（植酸和卵磷脂）對禾谷鐮刀菌生長及致病力的影響進行研究，以期為耕地地力影響農(nóng)業(yè)有害生物發(fā)生的機制與調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考，為東北玉米主產(chǎn)區(qū)玉米莖腐病的防治提供理論依據(jù)。
土壤有機磷是土壤磷庫的重要組成部分，包括植酸、核酸、磷脂、磷蛋白、糖脂和其他磷酸鹽等。植酸類有機磷占土壤有機磷的40%~80%，對土壤肥力和植物營養(yǎng)的作用受到廣泛關(guān)注。按Bowman-Cole分級體系，土壤有機磷組分中，中活性有機磷（植酸及其鹽類）是構(gòu)成有機磷的主要組分，活性有機磷（核酸）所占有機磷的比例最小。與無機磷相比，有機磷具有在土壤中移動性強的優(yōu)點，土壤中磷素的移動絕大部分是有機磷形態(tài)，只有小部分可直接被植物根系吸收，其他必須經(jīng)過進一步礦化為無機磷才能被植物吸收。由于土壤有機磷的礦化不僅通過磷素有效性而且還通過影響根際微生物的性質(zhì)影響植物的生長，因此，研究土壤有機磷對有害生物種群數(shù)量及其致病力的影響，對揭示不同地力因素與土傳病害發(fā)生的關(guān)系，為土傳病害防治措施提供理論依據(jù)具有重要意義。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1供試菌種
禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），由吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院高潔教授提供，分離于玉米莖腐病的病變組織。
1.1.2供試培養(yǎng)基
無磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基：硝酸鈉2.0 g，蔗糖30.0 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，純凈水1 000 mL，pH 7.0，配制固體培養(yǎng)基加18 g瓊脂；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC）。
1.1.3供試磷源
K2HPO4，植酸，卵磷脂。
1.1.4供試玉米品種
吉農(nóng)大58。使用無菌水和無磷培養(yǎng)基測試種子發(fā)芽率分別為98.00%和98.33%，兩組測試結(jié)果無顯著差別。
1.1.5盆栽試驗試供試土壤
供試土壤為黑土，土壤基本理化性狀：含水量14.91%，有機碳15.26 g/kg，堿解氮89.12 mg/kg，有效磷16.43 mg/kg，速效鉀82.89 mg/kg，pH 6.73。
1.2不同有機磷源對禾谷鐮刀菌生長及代謝產(chǎn)物的影響
試驗設(shè)置3種磷源（卵磷脂、植酸和K2HPO4），4個磷濃度梯度（0.043 8，0.438，4.38，43.8 mmol/L），總計12個處理，每個處理3次重復(fù)。
1.2.1不同磷源對禾谷鐮刀菌生長的影響
（1）十字交叉法：用滅菌打孔器在PDA培養(yǎng)基上打取經(jīng)活化培養(yǎng)的直徑為5 mm的禾谷鐮刀菌菌碟，分別接種在以卵磷脂、植酸、K2HPO4為唯一磷源的固體培養(yǎng)基上，對照為K2HPO4，置于25℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每隔24 h進行菌落直徑的測定，以其中一個處理長滿平皿結(jié)束測量。菌落實際直徑（cm）=測量直徑（cm）-0.5。
（2）干重法：將100 mL以卵磷脂、植酸、K2HPO4為唯一磷源的液體培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶內(nèi)，K2HPO4作為對照組，總計12個處理，每個處理3次重復(fù)。用打孔器在PDA培養(yǎng)基上打取直徑5 mm菌碟放入CMC液體培養(yǎng)基中，在25℃光照條件下振蕩培養(yǎng)（170 r/min）5 d。顯微鏡下觀察產(chǎn)生大量分生孢子后，發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)3層無菌紗布過濾掉菌絲，濾液經(jīng)1.0萬r/min離心10 min后收集孢子，加適量滅菌去離子水制成孢子懸浮。每個處理分別接種1 mL禾谷鐮刀菌的孢子懸液（2.0×106 CFU/mL，CFU為菌落數(shù)），25℃振蕩（170 r/min）培養(yǎng)5 d，離心（1×105 r/min）收獲菌絲，用無菌水反復(fù)清洗5次，105℃烘干至恒重后測定菌絲干質(zhì)量。生物量（菌絲質(zhì)量）=總質(zhì)量-定量濾紙質(zhì)量。
1.2.2不同磷源對禾谷鐮刀菌代謝產(chǎn)物的影響
（1）生測法：將上述培養(yǎng)液高速離心（1×105 r/min），取上清液（約100 mL），于121℃條件下滅菌20 min，冷卻后，取15 mL倒入鋪有雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，將經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)為5%的次氯酸鈉溶液表面消毒后的玉米種子20粒整齊擺放其中，以無磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基離心上清液為對照，總計13個處理，每個處理3次重復(fù)。置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后取出，分別測定種子萌發(fā)率，胚根和胚芽的長。萌發(fā)抑制率和胚根（胚芽）生長抑制率計算公式：萌發(fā)抑制率（%）=［（對照萌發(fā)率-毒素處理萌發(fā)率）/對照萌發(fā)率］×100；胚根（胚芽）生長抑制率（%）=［（對照平均長-處理平均長）/對照平均長］×100。
（2）代謝產(chǎn)物的鑒定：取上述經(jīng)高溫高壓滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)濾液1.0 mL于10 mL離心管中，加入5 mL提取液（體積分數(shù)為80%的甲醇水溶液），使用漩渦混勻器振蕩5 min后，4 000 r/min離心1 min，取上清液。取100μL離心上清液加入1 000μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3~5 s，取100μL分別加入到DON毒素熒光定量檢測試紙條加樣孔中。置于37℃恒溫孵育器中溫育8 min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀（FD-600型，上海飛測生物科技有限公司）中讀數(shù)，讀數(shù)值即為樣品實際檢測濃度。每個樣品測3次，取平均值。
1.3不同有機磷源對禾谷鐮刀菌致病力的影響
采用盆栽幼苗傷口接種法。制備3種磷源（磷濃度為43.8 mmol/L）培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌制成的菌碟。以無菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，總計4個處理，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。
將采集的健康無病的玉米田黑土過3 mm（6目）篩，去除礫石和植物殘體后，按m（N）∶m（P）∶m（K）=29∶13∶10，0.06 kg/m2施肥水平將土壤與肥料混勻后，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大持水量的70%，裝盆，每盆2.5 kg。每個處理20盆，總計240盆。挑選子粒飽滿的玉米種子，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為5%的次氯酸鈉溶液表面消毒。待種子發(fā)芽后，種在育苗盆中，每盆種2株，于25℃光照培養(yǎng)室中培育，待玉米幼苗生長定植后，留健壯玉米苗1株，長至15 cm高時進行致病菌接種。在莖基部用牙簽輕挑3個傷口，貼上菌碟后用保鮮膜纏繞包裹好，放回培養(yǎng)室中繼續(xù)保濕培養(yǎng)，5 d后觀察發(fā)病情況。
玉米苗期病害的病情級別分為4級：0級，健康，整株植株生長正常，未見任何發(fā)?。?級，輕度發(fā)病，玉米苗接種部位有輕微色變，沒有病斑產(chǎn)生；3級，中度發(fā)病，玉米植株莖基部發(fā)生顯著色變，出現(xiàn)少量病斑；5級，重度發(fā)病，接種部位變成褐色，病斑明顯。有些接種部位莖基完全潰爛，甚至造成植株死亡。發(fā)病率和病情指數(shù)計算公式：
發(fā)病率（%）=（病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100；
病情指數(shù)=［∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級值）］×100。
1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法
采用Excel 2016和SPSS25.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異性分析。
2結(jié)果與分析
2.1卵磷脂、植酸對禾谷鐮刀菌生長的影響
在十字交叉法培養(yǎng)試驗中，根據(jù)每天菌落直徑的變化，繪制禾谷鐮刀菌生長曲線，見圖1，卵磷脂、植酸和K2HPO4菌落直徑隨時間變化均呈上升趨勢，說明禾谷鐮刀菌能利用3種磷源用于自身生長。在保證培養(yǎng)基中3種磷源磷的物質(zhì)的量濃度相等的條件下進行比較，以卵磷脂為唯一磷源培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌菌落生長速度明顯快于對照組K2HPO4。當培養(yǎng)基中磷濃度為4.38 mmol/L時，卵磷脂組在生長6 d菌落直徑已經(jīng)達到8.5 cm，而K2HPO4培養(yǎng)基在7 d時菌落直徑還未達到7.0 cm（圖1）?；A(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同磷源對禾谷鐮刀菌生長速度的影響見圖2?？梢?，植酸與K2HPO4之間無明顯差異，卵磷脂較K2HPO4相比更利于禾谷鐮刀菌菌落生長。
圖1基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同磷源對禾谷鐮刀菌生長的影響
圖2磷濃度為4.38 mmol/L培養(yǎng)基中禾谷鐮刀菌實際生長情況
土壤有機磷源卵磷脂和植酸對禾谷鐮刀菌菌絲生長和致病力的影響（一）
土壤有機磷源卵磷脂和植酸對禾谷鐮刀菌菌絲生長和致病力的影響（二）
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