1.4噬菌體生物學特性研究
1.4.1噬菌體裂解譜測定
將表2所述待測菌株提前復蘇并在搖床中37℃、200 r/min孵育6h至生長對數(shù)期，將100μL對應菌株的菌液與高壓冷卻至40℃左右的900μL LB半固體培養(yǎng)基混合均勻后倒入LB固體培養(yǎng)基上，靜置等待其晾干。用移液器槍頭吸取5μL噬菌體液滴加在培養(yǎng)基表面，重復三次，并在同一平板上滴加等量生理鹽水作為空白對照，待培養(yǎng)基表面干燥后將培養(yǎng)基倒置放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日取出觀察有無噬菌斑。
表2噬菌體宿主譜
1.4.2最佳感染復數(shù)測定
提前過夜復蘇宿主菌雞白痢沙門菌C79-13至對數(shù)期，涂布平板計數(shù)菌落數(shù)量后調整至1.0×107 CFU/mL，按照感染復數(shù)(MOI)(每毫升噬菌體數(shù)量/每毫升宿主菌數(shù)量)為10、1、0.1、0.01、0.001在離心管中分別加入100μL噬菌體上清液和100μL菌液，并在各離心管中加入LB液體培養(yǎng)基至2 mL使各個體系的總體積保持相同，振蕩混勻后置于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)6 h，后取出10 000×g離心15 min，取上清液，通過雙層平板法測定噬菌體效價，計算得最高噬菌體效價對應的MOI即為本株噬菌體對應的最佳MOI。
1.4.3一步生長曲線測定
取5 mL 1.0×107 CFU/mL宿主菌菌液于15 mL離心管中，根據1.4.2中測得的最佳MOI比例加入相應體積的噬菌體液，并加入滅菌LB液體培養(yǎng)基保持反應體系為10 mL，振蕩混勻后在37℃、200 r/min搖床孵育2 h。在2 h培養(yǎng)過程中，每間隔10 min取出0.5 mL培養(yǎng)物，10 000×g離心10 min后棄去沉淀并將上清液過0.22μm濾器，用雙層平板法測定、用GraphPad Prism8.0軟件繪制一步生長曲線，同時根據數(shù)據計算出噬菌體的潛伏期、爆發(fā)期和裂解量。裂解量為爆發(fā)末期噬菌體效價與感染初期宿主菌濃度的比值。
1.4.4噬菌體紫外線敏感性測定
取10 mL噬菌體液于空培養(yǎng)皿中，在距離紫外線30 cm處照射，分別間隔5 min從中取樣1 mL，并用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價，重復三次。
1.4.5噬菌體酸堿度耐受程度測定
配制pH范圍為2.0~13.0的LB液體培養(yǎng)基，并在各管中加入效價為1.0×108 PFU/mL的噬菌體液，用移液器槍頭吹打混勻，在37℃靜置1 h后取出用雙層平板法測定噬菌體效價，重復三次。
1.4.6噬菌體溫度敏感性測定
各取500μL噬菌體液于1.5 mL離心管中，準備同樣的7管，置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴，各管分別在30 min、60 min、90 min后取樣，每次取100μL用雙層瓊脂平板法測定樣本中噬菌體效價，重復三次。
1.5噬菌體全基因組測序及生物信息學分析
1.5.1噬菌體全基因組測序
用天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取沙門菌噬菌體PC79-13的基因組，按照試劑盒指示操作，提取后樣品委托蘇州金唯智生物公司進行二代Illumina測序。獲得原始數(shù)據后，先用Fastp對數(shù)據進行自動化過濾和質控，將數(shù)據預處理，最后將質控數(shù)據用Spades進行組裝，得到完整序列。
1.5.2噬菌體生物信息學分析
基于美國國家生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據庫比對與本實驗分離得到的沙門菌噬菌體基因組相似的其他噬菌體基因組，并用CGView軟件繪制噬菌體全基因組圈圖。通過毒力因子數(shù)據庫和抗生素耐藥綜合數(shù)據庫篩選假定的毒力因子和抗生素耐藥性基因等?；诎ū緦嶒灧蛛x出的噬菌體在內的20個噬菌體的主要衣殼蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，用Mega X軟件對噬菌體進行進化分析。用OAT軟件進行基因組熱圖繪制，對分離純化出的噬菌體提取基因組并對基因組測序，經BLAST序列比對分析噬菌體基因組已知的基因功能蛋白，確定噬菌體基因屬性，從基因水平上解析噬菌體。
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