為了探索抗噬菌體重組鈍齒棒桿菌的應用可行性,對重組質粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的穩(wěn)定性以及其對宿主細胞生長代謝的影響進行了研究。實驗結果表明,重組質粒在鈍齒棒桿菌中具有較好的穩(wěn)定性,它在鈍齒棒桿菌中的存在對重組菌株的早期生長有些影響,但未影響重組菌株的谷氨酸產(chǎn)生量。
鈍齒棒桿菌是產(chǎn)生谷氨酸的菌株之一,其不同衍生株在生產(chǎn)中得到了廣泛應用。然而,由于發(fā)酵生產(chǎn)的規(guī)模化和連續(xù)性,生產(chǎn)中的菌種極易感染噬菌體,所以噬菌體污染一直是影響谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的關鍵因素之一。雖然通過改進生產(chǎn)工藝,改善衛(wèi)生條件,控制生產(chǎn)環(huán)節(jié),噬菌體污染現(xiàn)象有所減輕,但仍時常發(fā)生[1-2]。為了解決谷氨酸發(fā)酵中的噬菌體污染問題,利用質粒攜帶的cglⅠ基因復合體構建了抗噬菌體鈍齒棒桿菌基因工程菌,證實了cglⅠ基因復合體在鈍齒棒桿菌中的抗噬菌體功能活性[3]。由于構建抗噬菌體基因工程菌的策略采用的是質粒表達外源基因,而且表達的外源基因是限制修飾(RM)系統(tǒng)基因復合體,所以重組質粒以及其所攜帶的RM在鈍齒棒桿菌中的行為如何尚需實驗證實。為此,本文對重組質粒在鈍齒棒桿菌中的穩(wěn)定性以及其對宿主細胞生長代謝的影響進行了研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株鈍齒棒桿菌T6-13(野生型)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心,含有質粒pJL23-cglⅠ的重組鈍齒棒桿菌由本實驗室構建[3]。
1.1.2噬菌體5株噬菌體AS-I V3C44～ASI V3C48購自武漢病毒研究所。
1.2方法
1.2.1菌株培養(yǎng)鈍齒棒桿菌T6-13(野生型)和重組鈍齒棒桿菌培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基(固體或液體),需要時添加50μL/mL卡那霉素。
1.2.2噬菌體裂解液的制備具體方法參見文獻[4]。
1.2.3噬菌體效價測定具體方法參見文獻[4]。噬菌體效價(pfu/mL)=噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。
1.2.4噬菌體抗性檢測采用平板空斑法,成斑率(Efficiency of plaquing,EOP)計算方法：成斑率EOP=抗性菌株中噬菌體成斑數(shù)/敏感菌株中噬菌體成斑數(shù)，敏感菌株的EOP等于1。
1.2.5菌株傳代[6]在LB/Km-平板上劃線接種重組鈍齒棒桿菌,30℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落,連續(xù)劃線接種傳代100次。將傳代次數(shù)為1、10、20、30、……80、90、100的平板4℃保存。
1.2.6質粒分離穩(wěn)定性測定[6]從不同傳代次數(shù)(1、10、20、30、……80、90、100)的LB/Km-平板上,用無菌牙簽分別挑取100個單菌落,分別在LB/Km-和LB/Km+平板對應位置上劃短線,30℃過夜培養(yǎng)。計數(shù)不同代次重組菌株在LB/Km-和LB/Km+平板上的生長數(shù),計算重組菌株在無Km選擇壓力條件下質粒的丟失率。質粒穩(wěn)定性(%)=(LB/Km+平板上的生長數(shù))/(LB/Km-平板上的生長數(shù))×100%。
1.2.7質粒結構穩(wěn)定性測定[6]從不同傳代次數(shù)(原代、20、40、60、80、100)的LB/Km-平板上,用無菌牙簽分別挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,30℃過夜培養(yǎng)后,采用噬菌體抗性實驗檢測重組菌株質粒的結構穩(wěn)定性。
1.2.8生長曲線分析與測定
以野生菌株作對照,測定重組菌株的生長曲線,實驗重復3次,實驗數(shù)據(jù)為3次實驗的平均值。
1.2.9谷氨酸測定
重組菌株與野生菌株(對照)分別搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h,從20 h起開始取樣,每隔4 h取樣1次,取樣時間分別設為20、24、28、32、36、40、44、48 h。采用大腸埃希菌L-谷氨酸脫羧酶解法使谷氨酸分解成CO2氣體,用微量呼吸檢壓儀定量測定產(chǎn)生的CO2量,根據(jù)反應方程式計算出谷氨酸含量。實驗重復3次,實驗數(shù)據(jù)為3次實驗的平均值。
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