阪崎克羅諾桿菌（C ronobacter sakazakii,C.Sakazakii），是一種無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，可引起新生兒腦膜炎、敗血癥和腸炎。據(jù)報(bào)道，阪崎克羅諾桿菌感染早產(chǎn)嬰兒造成的死亡率可達(dá)到40%～80%。雖然前期研究已在嬰幼兒配方乳粉、飲料、奶酪、雞蛋、魚、禽肉、蝦、米飯、餃子、嬰幼兒食品輔料和一些零售食品等中間檢出阪崎克羅諾桿菌，但嬰幼兒配方乳粉（Pow dered In fant Form u la,PIF）被認(rèn)為是該菌最主要、最常見的傳播源及載體。
生產(chǎn)過程中PIF可能會被阪崎克羅諾桿菌污染，但細(xì)胞數(shù)一般較少。同時(shí)由于PIF中水分活度很低，阪崎克羅諾桿菌即使存在也無法生長繁殖。然而，沖調(diào)的復(fù)溶配方乳粉（R econstituted Pow dered In fant Form ula,RPIF）卻是該菌生長繁殖的良好營養(yǎng)基質(zhì)。日常生活中，很多情況下嬰幼兒不能一次性進(jìn)食完沖調(diào)的RPIF，在一些嬰幼兒護(hù)理中心、醫(yī)院甚至家庭中，醫(yī)護(hù)人員無法做到及時(shí)清洗奶瓶，若奶瓶貯藏溫度不適，原本存在于PIF中的少量阪崎克羅諾桿菌則可能在RPIF中快速生長繁殖，從而交叉污染或直接污染再次沖調(diào)的RPIF，導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)。
阪崎克羅諾桿菌在RPIF中的遲滯期、剩余RPIF或奶瓶的儲藏溫度、污染菌的細(xì)胞數(shù)量是影響其在RPIF中生長繁殖的決定性因素。為防止食用受到阪崎克羅諾桿菌污染的RPIF，本研究探討了幾個(gè)關(guān)鍵的培養(yǎng)參數(shù)對4、15、25、37℃（分別代表剩余RPIF和奶瓶在冰箱及不同季節(jié)室溫儲存的溫度）下RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響，預(yù)測阪崎克羅諾桿菌在RPIF中的生長規(guī)律，以便為有效減少醫(yī)院及家庭環(huán)境中相關(guān)病原菌的污染風(fēng)險(xiǎn)提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株
菌株C ronobacter sakazakii ATCC BAA 894，由中國食品藥品檢定研究院提供，用于生長曲線測定以及初級、二級模型建立。
1.1.2試劑
Luria-Bertani Agar（LB）和Brian Heart In fusion（BH I）培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；嬰幼兒配方乳粉由市場購買生產(chǎn)日期為同批次的某品牌金裝幼兒配方粉。
1.1.3儀器與設(shè)備
LAC-5080S高壓滅菌鍋，上海博訊；SW-CJ-1CU超凈工作臺，蘇州泰安；NU-425-400E生物安全柜，美國；微量移液槍，德國Effendorf；MIR-253-20℃超低溫冰箱，日本三洋；MDF-3286S-80℃超低溫冰箱，日本三洋；Q L-86旋渦振蕩器，其林貝爾；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏；XS204百分之一天平，梅特勒；78-1磁力攪拌器，常州國華；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴箱，天津泰斯特；BCD-205TA 4℃冰箱，青島海爾；全自動微生物生長曲線分析儀，Bioscreen C公司；ZHWY-211B搖恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏。
1.2方法
1.2.1菌株培養(yǎng)與菌落計(jì)數(shù)
將-80℃保存的菌液劃線于LB平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取一單菌落接種于200 m L BH I肉湯培養(yǎng)基，37℃、100 r/min搖床培養(yǎng)18～24 h。
通過菌落計(jì)數(shù)法確定BH I培養(yǎng)基中阪崎克羅諾桿菌的初始濃度。吸取1 m L的BH I培養(yǎng)物加入9 m L的生理鹽水中進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇2～3個(gè)適宜的稀釋度，取1 m L稀釋液涂布于LB平板，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)24 h，選取菌落數(shù)在30～300之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)，最終濃度以每毫升菌液的菌落形成單位（Co lony Forming Unit,CFU）平均值表示。
1.2.2 RPIF制備
根據(jù)奶粉外包裝袋上的使用說明沖調(diào)乳粉溶液。稱取30 g乳粉于120 m L滅菌水中，攪拌直至完全溶解。復(fù)溶乳粉分裝至50 m L離心管中，每管10m L，121℃滅菌20 min，冷卻備用。
1.2.3阪崎克羅諾桿菌生長曲線測定
將0.1 m L菌液接入分裝好的無菌RPIF中，接種菌液的終濃度控制在103～104CFU/m L。RPIF分別置于4、15、25、37℃條件下培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時(shí)間下阪崎克羅諾桿菌的活菌數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。
1.2.4初級模型建立
選取Gom pertz方程和Logistic方程2種初級模型預(yù)測菌株生長規(guī)律。
Gom pertz方程為公式（1）
該方程用于計(jì)算阪崎克羅諾桿菌在測試溫度下的遲滯時(shí)間λ（h），最大生長速率μm（h-1），培養(yǎng)時(shí)間無限增加時(shí)細(xì)菌數(shù)量的增量（A）。
Logistic方程為公式（2）：
式中，C為活菌總數(shù)（CFU/m L），Cmax為最大活菌總數(shù)。
1.2.5二級模型建立
根據(jù)細(xì)胞活菌數(shù)量化溫度對生長速率及遲滯時(shí)間的影響，模擬構(gòu)建生長模型。以修正的Gom pertz方程作為主要生長模型，得出與生長相關(guān)關(guān)鍵參數(shù)。二次模型構(gòu)建時(shí)，用R atkow sky平方根模型和二次R osso模型評估不同溫度下阪崎克羅諾桿菌的最大生長速率。使用R atkow sky模型和雙曲線方程反算結(jié)果的對數(shù)與遲滯期的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。
為了評估貯藏溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響，研究采用平方根模型擬合溫度與最大生長速率μmax，使用預(yù)測值和試驗(yàn)值之間的殘差以及比較用的溫度預(yù)測模型進(jìn)行驗(yàn)證。
1.2.6數(shù)據(jù)分析
采用Curve Expert1.4軟件對生長曲線進(jìn)行分析，利用Microsoft excel 2010建立二級預(yù)測模型，采用平方根模型擬合菌株最大生長速率μmax，評價(jià)貯藏溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響。
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