玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是由玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)所引起的以葉部產(chǎn)生大型病斑癥狀為主的玉米病害，其分布廣、危害重，是世界性的真菌病害[1-2]。玉米大斑病菌利用無性分生孢子傳播，以侵染性菌絲在玉米寄主組織內(nèi)擴(kuò)展，并通過產(chǎn)生HT毒素(Helminthosporiumturcicumtoxin)抑制寄主的防御體系，從而引起病害癥狀[3-4]。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)、附著胞產(chǎn)生、致病性和HT毒素活性都有重要的調(diào)控作用[5-8]。鞏校東等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌至少存在Hog1、Slt2、Fus3/Kss1和Ime2等4條MAPK途徑。谷守芹[11]利用候選基因法克隆了3個(gè)MAPK基因STK1、STK2和STK3，其中STK1基因?qū)儆贖og1-MAPK途徑，主要與滲透脅迫和應(yīng)激脅迫調(diào)節(jié)有關(guān)；STK2基因?qū)儆赟lt2-MAPK途徑，主要與病原菌的致病性和孢子發(fā)育有關(guān)；STK3基因?qū)儆贔us3/Kss1-MAPK途徑，主要與細(xì)胞壁合成有關(guān)。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，STK1基因不僅調(diào)控玉米大斑病菌的滲透脅迫調(diào)節(jié)，而且與菌絲、分生孢子和附著胞發(fā)育、毒素合成及致病性都有關(guān)。因此，STK1基因是調(diào)控玉米大斑病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性的重要MAPK基因。


王梅娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在1.0 mol/L NaCl高滲脅迫條件下玉米大斑病菌生長(zhǎng)受到抑制，甘油濃度增加，同時(shí)STK1基因的表達(dá)量穩(wěn)定增加，從而明確甘油是玉米大斑病菌主要的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。谷守芹[11]和Li等[12,14]的研究也證明，在NaCl、KCl、LiCl等鹽脅迫條件下STK1基因具有重要的滲透調(diào)節(jié)功能。植物病原真菌進(jìn)化了多條信號(hào)應(yīng)答途徑來適應(yīng)環(huán)境中的滲透壓變化，其中高滲透性甘油促分裂原激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(HOG-MAPK)是植物病原真菌中最主要的滲透脅迫調(diào)節(jié)途徑。該途徑通過促進(jìn)甘油積累、延緩細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)其他生理?xiàng)l件抵抗?jié)B透脅迫刺激[15]。在稻瘟病菌(Magnaportlregrisea)、炭疽病菌(Colletotrichnnrlagenarinm)、稻平臍蠕孢菌(Bipolarisoryzae)、栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)、小麥殼針孢(Mycosphaerellagraminicola)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerca)等植物病原真菌中均發(fā)現(xiàn)MAPK途徑，并克隆了相應(yīng)的Hog-MAPK同源基因[16]。但是在植物病原真菌高滲脅迫研究中，主要研究的是鹽脅迫對(duì)生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性的影響，對(duì)山梨醇等有機(jī)分子的滲透脅迫研究卻鮮見報(bào)道。


本研究利用玉米大斑病菌STK1基因的敲除突變體(knockout mutants，KO)，比較該突變體與野生型菌株(WT)在山梨醇脅迫下菌落生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)及脂類物質(zhì)在菌絲細(xì)胞內(nèi)沉積情況等方面的差異，分析玉米大斑病菌在山梨醇高滲脅迫下的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制，為進(jìn)一步明確STK1基因?qū)τ衩状蟀卟【鷿B透脅迫調(diào)節(jié)的分子機(jī)理，以及STK1基因在玉米大斑病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性等方面的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。


1材料與方法


1.1供試菌種


玉米大斑病菌野生菌株(WT)01-23及其STK1基因敲除突變體(KO)STM-35，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)谷守芹教授提供。


1.2試驗(yàn)材料和供試培養(yǎng)基


油紅O染液[17]：取油紅0.5 g，加異丙醇至100 mL，60℃水浴中加溫溶解30 min，配成油紅O儲(chǔ)備液，置于棕色小磨沙口瓶保存。臨用前取0.6 mL油紅O加蒸餾水0.4 mL，混合靜置10 min后用0.45μm濾膜過濾除菌。


PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，水1 000 mL。


DPA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂粉12 g，水1 000 mL。


1.3試驗(yàn)方法


1.3.1菌株培養(yǎng)和活化將試管內(nèi)保存的野生菌株01-23和突變體STM-35分別接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗倒置培養(yǎng)6 d后，再次轉(zhuǎn)接到PDA平皿上，培養(yǎng)至菌落直徑達(dá)到5 cm左右。


1.3.2適宜高滲脅迫分析培養(yǎng)基的篩選將野生菌株01-23分別接種于PDA和DPA培養(yǎng)基上，25℃黑暗倒置培養(yǎng)6 d后，挑取菌絲于潔凈載玻片上，滴入適量PBS緩沖液，置于顯微鏡下觀察。


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