益生菌是指攝入足夠量后，對(duì)人體健康產(chǎn)生益處的一類(lèi)活的微生物的總稱(chēng)。乳桿菌屬、雙歧桿菌屬，以及乳球菌、嗜熱鏈球菌和酵母菌等作為目前益生菌產(chǎn)業(yè)中主要應(yīng)用的微生物，其的安全性與穩(wěn)定性問(wèn)題不容忽視。
益生菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn)極嚴(yán)格，大多數(shù)菌株通常來(lái)自于無(wú)致病菌歷史、健康人群的胃腸道。菌株需具備在胃腸道中定植的能力，同時(shí)兼具較高的耐酸和耐膽鹽能力。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)菌株全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行深度分析，并結(jié)合微生物學(xué)檢測(cè)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)等，對(duì)其所攜帶的耐藥基因、致病性基因和環(huán)境抗性基因進(jìn)行系統(tǒng)闡述。以人群試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)結(jié)果為重要評(píng)判指標(biāo)，最終確定菌株是否具有安全性。然而，隨著菌株的流通和廣泛使用，菌株往往會(huì)出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為，原有形態(tài)變得不典型，發(fā)酵周期變長(zhǎng)，發(fā)酵特性變差，抗不良環(huán)境減弱等生物學(xué)特性。因此，深入研究與評(píng)估益生菌的遺傳穩(wěn)定性具有重要意義。
鼠李糖乳桿菌Probio-M9是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)團(tuán)隊(duì)于2017年從健康婦女母乳樣中分離得到的1株具有潛在益生特性的益生乳酸菌，其在胃腸液中具有較強(qiáng)的存活率，同時(shí)鼠李糖乳桿菌Probio-M9還可通過(guò)腸道-腦軸途徑改善應(yīng)激后成人的心理和生理生活質(zhì)量以及通過(guò)調(diào)節(jié)腸道環(huán)境和改善炎癥來(lái)抑制大腸腫瘤的形成等。本研究以鼠李糖乳桿菌Probio-M9為研究對(duì)象，從菌株形態(tài)變化、碳水化合物利用能力以及菌株代謝特性等多方面對(duì)其在連續(xù)傳代培養(yǎng)（100代）過(guò)程中的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合比較基因組學(xué)深入分析其遺傳穩(wěn)定性，找尋其進(jìn)化的基本規(guī)律，確保其具備優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性，為鼠李糖乳桿菌Probio-M9后續(xù)更深層次的研究提供理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1菌株來(lái)源
鼠李糖乳桿菌Probio-M9菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫(kù)（LABCC）提供。
1.1.2設(shè)備與儀器
HWS28型電熱恒溫水浴鍋，天津知署科技有限公司；立式低速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技儀器有限公司；DG250厭氧工作站，英國(guó)DWS公司；EF20 pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；UV-1100微量紫外分光光度計(jì)，NanoDrop公司；BX50光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Applied biosystems PCR儀，伯樂(lè)公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1鼠李糖乳桿菌Probio-M9連續(xù)傳代培養(yǎng)方法
1.2.1.1繪制生長(zhǎng)曲線
將鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始菌種從-80℃保藏環(huán)境中取出，活化后接種到液體MRS培養(yǎng)基中（設(shè)置3組平行），接種量為1%。在37℃恒溫條件下、厭氧培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光值，確定菌株到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間。
1.2.1.2菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)
將鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始菌種從-80℃保藏環(huán)境中取出，活化2代后，在固體MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線操作，并將劃線后平板于37℃恒溫條件下培養(yǎng)72 h后，隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落，每個(gè)單菌落分別接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫條件下厭氧培養(yǎng)24 h，再接種到相應(yīng)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代，接種量為1%，將第0，25，50，75，100代分別標(biāo)記為A0、A25、A50、A75和A100。
1.2.1.3菌株培養(yǎng)代數(shù)計(jì)算
以1.2.1.1節(jié)確定的穩(wěn)定期時(shí)間作為傳代培養(yǎng)時(shí)間，將菌株以1%接種量接入新鮮液體培養(yǎng)基時(shí)的初始活菌數(shù)記為N0，穩(wěn)定期時(shí)的活菌數(shù)記為Nf，通過(guò)公式log2100（Nf／N0）計(jì)算一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)的生長(zhǎng)代數(shù)（也即細(xì)菌進(jìn)行分裂的次數(shù)）。
1.2.1.4菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞、菌落形態(tài)觀察
鼠李糖乳桿菌Probio-M9連續(xù)培養(yǎng)100代過(guò)程中，對(duì)不同代時(shí)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)胞、菌落形態(tài)，初步檢驗(yàn)菌株純度，并保留A0、A25、A50、A75和A100代革蘭氏染色鏡檢圖片。
1.2.1.5菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程碳水化合物代謝能力檢測(cè)
鼠李糖乳桿菌Probio-M9在連續(xù)培養(yǎng)100代過(guò)程中，采用梅里埃碳水化合物鑒定（API 50CH）試劑盒分析其利用49種碳水化物化合物（表1）的代謝能力，將A0、A25、A50、A75和A100代菌懸液吸取至BioMerieux API 50CHL碳水化合物鑒定試劑條中，并用無(wú)菌石蠟封口，37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行結(jié)果判定。培養(yǎng)液中所含溴甲粉紫指示劑變?yōu)辄S色（25號(hào)管變?yōu)楹谏殛?yáng)性反應(yīng)，表明該菌株可代謝對(duì)應(yīng)的碳水化合物；不變色為陰性反應(yīng)，表明該菌不可代謝對(duì)應(yīng)碳水化合物。
表1 API 50CHL乳桿菌鑒定系統(tǒng)各種碳水化合物一覽表
1.2.1.6菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程代謝產(chǎn)物檢測(cè)
保留鼠李糖乳桿菌Probio-M9 A0、A25、A50、A75及A100代菌液的上清液，以苯乳酸（Phenyllactic acid）、檸檬酸（Citric acid）、酒石酸（Tartaric acid）、蘋(píng)果酸（Malic acid）、琥珀酸（Succinic acid）、4-羥基苯乳酸（4-Hydroxyphenyllactic acid）、苯甲酸（Benzoic acid）、草酸（Oxalate）、水楊酸（Salicylic acid）、苯丙酸（Propionic acid）、乳酸（Lactic acid）、丙酸（Propionic acid）、丁酸（Butyrate）、己酸（Hexanoic acid）、乙酸（Acetic acid）物質(zhì)為標(biāo)品，進(jìn)行靶向代謝物測(cè)定。
1.2.2鼠李糖乳桿菌Probio-M9連續(xù)傳代過(guò)程比較基因組學(xué)研究
1.2.2.1基因組DNA提取及純度檢測(cè)
對(duì)鼠李糖乳桿菌Probio-M9第0，25，50，75，100代的DNA進(jìn)行提取，提取到的DNA通過(guò)Nanodrop超微量分光光度計(jì)平臺(tái)進(jìn)行純度測(cè)定，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA完整度及純度進(jìn)行檢測(cè)。使用經(jīng)典STE法對(duì)菌株的全基因組進(jìn)行提取，純度檢測(cè)同上，使用Qubit熒光定量?jī)x進(jìn)行濃度檢測(cè)，滿(mǎn)足要求后通過(guò)Nanopore三代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組的測(cè)序。
1.2.2.2組裝及環(huán)化
通過(guò)NextDenovo軟件完成3代數(shù)據(jù)的組裝，進(jìn)一步使用circlator軟件將三代數(shù)據(jù)進(jìn)行環(huán)化，采取CGview在線軟件對(duì)環(huán)化結(jié)果可視化。通過(guò)pilon軟件使用二代數(shù)據(jù)對(duì)三代數(shù)據(jù)進(jìn)行polish。參照Perl腳本統(tǒng)計(jì)15株不同代時(shí)菌株基因組信息。
1.2.2.3平均核苷酸一致性（ANI）計(jì)算
15株不同代時(shí)菌株基因組與鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始基因組進(jìn)行ANI計(jì)算，借鑒Goris等報(bào)道的方法，用自制Perl腳本比較菌株之間的ANI值。TBtools軟件進(jìn)行ANI聚類(lèi)熱圖繪制。
1.2.2.4單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）位點(diǎn)分析
DNA傳代過(guò)程中，SNP位點(diǎn)常作為分子突變標(biāo)記之一，單個(gè)堿基的插入或缺失導(dǎo)致的單個(gè)核苷酸發(fā)生突變從而導(dǎo)致DNA序列的改變。利用Soapsnp軟件對(duì)三代序列進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)。Samtools軟件對(duì)二代數(shù)據(jù)進(jìn)行突變堿基識(shí)別。
1.2.2.5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建
將1.2.2.4節(jié)中識(shí)別到的SNP
位點(diǎn)整理成序列，在軟件iTol內(nèi)將基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行可視化。
1.2.2.6共線性分析
本研究中將鼠李糖乳桿菌Probio-M9與5個(gè)不同代時(shí)的15株全基因組序列在Mauve（v2.3.1）軟件內(nèi)進(jìn)行共線性分析。
1.3數(shù)據(jù)處理
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