土壤微生物能分解和合成有機(jī)物，參與全球元素循環(huán)，它們能夠以互利共生的方式活躍于植物根表，形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的根際微生物群落，影響植物營(yíng)養(yǎng)吸收和健康［1］。這些聚集于根際的微生物群落形成了植物“第二基因組”［2-3］。根際微生物與植物的關(guān)系類似于腸道微生物與人體的關(guān)系［4］。植物能通過(guò)根際分泌物以及免疫系統(tǒng)物質(zhì)調(diào)節(jié)根際微生物群落的構(gòu)成，而根際微生物也能通過(guò)代謝活動(dòng)參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育、養(yǎng)分吸收和脅迫響應(yīng)等過(guò)程［1］。盡管越來(lái)越多的根際微生物被研究，揭示出有促生與生防功能，但根際微生物與植物建立的作用關(guān)系是否長(zhǎng)久穩(wěn)定，仍不清楚。
隨著人們對(duì)過(guò)度施用化肥引起的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題的重視，農(nóng)業(yè)綠色持續(xù)發(fā)展的關(guān)注，包括尿素、二胺等氮肥過(guò)剩引起的土壤元素不平衡、植物徒長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)低和水體污染、富營(yíng)養(yǎng)化，甚至誘發(fā)大氣中氮氧化物等溫室氣體含量增加等問(wèn)題［5］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，替代如氮肥等化肥，減輕其引起的環(huán)境問(wèn)題，已經(jīng)刻不容緩。微生物研究者關(guān)注到根際微生物的潛在價(jià)值，憑借微生物的固氮作用，探究施用菌劑替代氮肥的可行性。雷海英等［6］采用阿須貝氏（Ashby）無(wú)氮培養(yǎng)基，從苦參的根際土中篩選到2株根際固氮菌，分別隸屬于芽孢桿菌屬和假單孢菌屬，將菌劑添加到苦參幼苗中，生長(zhǎng)30 d后顯示出添加菌劑增加了植株的株高和葉片數(shù)，促進(jìn)了植物幼苗生長(zhǎng)。薛智權(quán)等［7］采用Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基篩選到2株具有固氮能力的細(xì)菌，黃芪種子分別經(jīng)2種菌液浸泡后種植，與未浸泡菌液的對(duì)照相比，株高分別增加了17.8%和64.4%，葉片數(shù)也顯著增加。程杰杰等［8］研究分離自玉米根際的固氮菌株對(duì)玉米和水稻的促生效果，結(jié)果顯示，施用菌液對(duì)玉米和水稻的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。然而，篩選的根際促生細(xì)菌是否能夠穩(wěn)定地促進(jìn)植物生長(zhǎng)，或者頻繁地施加促生菌菌劑是否會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，卻鮮有報(bào)道。
番茄（Lycopersicon esculentum）屬于管狀花目茄科番茄屬，是世界上價(jià)值較高的水果和蔬菜［9］。我國(guó)是世界上最大的番茄生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)家之一，2021年我國(guó)番茄產(chǎn)量達(dá)6 609萬(wàn)t，在蔬菜作物中位居榜首［10-11］。我國(guó)番茄種植方式已從露天種植逐步轉(zhuǎn)向大棚設(shè)施內(nèi)，提質(zhì)、增效和集約化管理、生物防治、減肥減藥的原則逐漸深入人心［10］。探究施用根際細(xì)菌對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響，具有推動(dòng)番茄健康發(fā)展的重要意義。筆者采用Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基從番茄根際土中篩選根際固氮菌，研究根際細(xì)菌對(duì)番茄幼苗根系及生長(zhǎng)的影響，揭示根際細(xì)菌在番茄栽培中的應(yīng)用潛力與風(fēng)險(xiǎn)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
菌株篩選于番茄根際土壤，該土壤樣品為2022年3月采集于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽(yáng)試驗(yàn)基地大棚內(nèi)結(jié)果期番茄植株根際。
盆栽試驗(yàn)供試番茄品種為晉番茄四號(hào)；栽培基質(zhì)采用蛭石；栽培花盆的規(guī)格為直徑12.0 cm×高12.5 cm×底徑10.0 cm。
1.2培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121℃高壓蒸汽滅菌21 min備用。
LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂16.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121℃高壓蒸汽滅菌21 min備用。
阿須貝氏（Ashby）無(wú)氮培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂15.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 6.8～7.0。
1.3菌株篩選與鑒定
稱量采集的番茄根際土1 g，將土樣置于含有玻璃珠的錐形瓶中，添加99 mL無(wú)菌水，然后37℃、170 r/min振蕩30 min，獲得土壤懸濁液。取懸濁液1 mL，使用梯度稀釋法，稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的懸濁液。然后每一濃度吸取200μL涂布到Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基平板上。上述過(guò)程重復(fù)３次。37℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小、顏色、邊緣、光澤、透明度等。使用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的菌落，分別在新的Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基平板上反復(fù)純化，挑取單菌落反復(fù)純化至少7次。將純化的菌株接種到LB固體培養(yǎng)基斜面和Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基斜面上，置于4℃冰箱保存以供下一步使用。另添加20%甘油若滴，保存于-80℃冰箱內(nèi)。該過(guò)程最終篩選獲得5株菌株，分別命名為F1、FN1、FN2、FN3、FN6。
菌株鑒定采用16S rDNA的分子鑒定方法。收集1 mL OD600為1.0～1.5的細(xì)菌菌液，離心棄上清后加入含有酶RNase A的緩沖液，加入溶菌酶，室溫靜置5 min，反復(fù)離心、沖洗與水浴，提取細(xì)菌的基因組DNA。采用引物27F和1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為基因組DNA 1.0μL，10×Buffer（含Mg2+）5.0μL，Taq聚合酶1.0μL，dNTP 1.0μL，正反引物各1.5μL，補(bǔ)充ddH2O至50.0μL。程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸7 min。按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。使用ABI3730-XL測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得物質(zhì)序列相似性最大的物種信息，作為鑒定結(jié)果。
1.4菌液的制備
使用接種環(huán)分別挑取在LB固體培養(yǎng)基平板上活化的5株菌株的單菌落，接種至250 mL LB液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3次。30℃170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，獲得菌液。將重復(fù)培養(yǎng)獲得的菌液混合搖勻，用于盆栽試驗(yàn)。
1.5盆栽試驗(yàn)
自2023年2月12日至3月28日，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，以自然光為光照條件，溫度維持在15～35℃，濕度維持在40%～65%。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，以番茄作為供試植物，分別添加篩選到的菌株F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌液作為處理，添加未接種菌株的培養(yǎng)液作為對(duì)照CK，設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每盆保留2株植株，共36盆。
挑選外形大小一致且飽滿的番茄種子，用75%乙醇溶液浸泡5 min進(jìn)行消毒，然后使用蒸餾水沖洗3次，再將種子浸泡在含有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)。栽培基質(zhì)選取蛭石，先采用高壓蒸汽滅菌法121℃、90 min進(jìn)行滅菌，然后晾干?；ㄅ枋褂?5%乙醇進(jìn)行消毒。在每個(gè)花盆中裝入滅菌的蛭石500 g，然后將番茄種子點(diǎn)播到蛭石表面2 cm以下，每盤點(diǎn)播3粒。采用稱重法保持含水量為80%。10 d出苗后，保留長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，每盆間苗為2株，每盆澆灌Hogland營(yíng)養(yǎng)液20 mL。繼續(xù)種植14 d后，進(jìn)行施用菌劑處理。分別添加F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌株制成的菌液和未接種菌株的培養(yǎng)液100 mL，24和34 d后，都再次施用相應(yīng)的菌液100 mL。44 d后，測(cè)量番茄植株的株高、莖粗和SPAD值，然后收獲植株。
1.6指標(biāo)測(cè)量
株高的測(cè)量使用精度為1 mm的直尺；莖粗的測(cè)量使用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺；SPAD值的測(cè)量使用葉綠素儀SPAD-502 Plus（Konnica Monlta，日本）。
鮮重的測(cè)量使用精度為0.01 g的電子天平稱量植株的地上部和根系；干重的測(cè)量使用烘箱70℃對(duì)測(cè)完鮮重的植物樣品烘干2 d，再使用精度為0.000 1 g的電子天平稱量。
根直徑、根總長(zhǎng)、根總面積和根總體積的測(cè)量使用根系掃描儀Epson Twain Pro（Epson，日本）對(duì)平鋪的植物根系進(jìn)行掃描，然后使用根系形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)分析軟件WINRhizo分析計(jì)算；地上部投影面積的測(cè)量同樣使用根系掃描儀Epson Twain Pro對(duì)平鋪的植物地上部（包括葉片和莖）進(jìn)行掃描，然后使用軟件WINRhizo分析計(jì)算。
1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
分別將5種菌株處理的指標(biāo)與對(duì)照的指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.05標(biāo)記*，P<0.01標(biāo)記**。統(tǒng)計(jì)分析使用軟件SPSS 16.0進(jìn)行。
根際細(xì)菌對(duì)番茄幼苗根系及生長(zhǎng)的影響、應(yīng)用潛力與風(fēng)險(xiǎn)（一）
根際細(xì)菌對(duì)番茄幼苗根系及生長(zhǎng)的影響、應(yīng)用潛力與風(fēng)險(xiǎn)（二）
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