2.4噬菌體的全基因組測(cè)序及親緣性分析
由測(cè)序結(jié)果可知，噬菌體vB-EcoM-IME540的全基因組大小為170 237 bp，G+C含量為39.46%，在DNAMan上序列組成分別為A:30.7%、C:19.1%、G:20.3%、T:29.8%，由此可知此噬菌體的核酸類型為dsDNA。利用MEGA7.0.26與NCBI上基因庫(kù)中的親緣噬菌體進(jìn)行基因比對(duì)，制作其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4，通過(guò)Blastn發(fā)現(xiàn)vB-EcoM-IME540與NCBI上發(fā)布的大腸桿菌噬菌體Bp7的相似性為97.44%(Bp7的GenBank登錄號(hào)為NC019500.1)，并已知大腸桿菌噬菌體Bp7是肌尾科噬菌體，結(jié)合電鏡形態(tài)觀察可將噬菌體vB-EcoM-IME540歸類為肌尾噬菌體家族。
圖4噬菌體vB_EcoM_IME540的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
2.5噬菌體的裂解譜
噬菌體vB-EcoM-IME540與45株雞大腸埃希氏菌作用，測(cè)定其裂解譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體vB-EcoM-IME540只對(duì)其中3株雞大腸埃希氏菌有裂解作用，裂解率約為6.67%(3/45)。
2.6噬菌體的最佳MOI
不同比例的噬菌體與宿主菌反應(yīng)時(shí)，子代噬菌體的產(chǎn)生情況也大不相同，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)MOI=0.000 001時(shí)，產(chǎn)生的子代噬菌體滴度最高，見(jiàn)圖5。因此，噬菌體vB-EcoM-IME540感染宿主菌的最佳MOI為0.000 001。
圖5噬菌體vB-EcoM-IME540的感染復(fù)數(shù)
2.7噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線
裂解性噬菌體的感染過(guò)程經(jīng)歷吸附、穿入、合成與裂解釋放4個(gè)階段，可用一步生長(zhǎng)曲線進(jìn)行描述與展示。從圖6可以清晰地看出，噬菌體vB-EcoM-IME540增殖的潛伏期、裂解期、平穩(wěn)期以及裂解量；其中潛伏期大約為20 min，裂解爆發(fā)期約為130 min，裂解量約為23 PFU/cell；大約在噬菌體感染宿主菌的150 min進(jìn)入平穩(wěn)期，此時(shí)宿主菌全部裂解，噬菌體數(shù)量達(dá)到最高。
圖6噬菌體vB-EcoM-IME540的一步生長(zhǎng)曲線
2.8噬菌體的pH敏感性
由圖7可知，噬菌體vB-EcoM-IME540在pH為4.0～13.0之間對(duì)噬菌體的影響不大，其效價(jià)無(wú)明顯變化并保持在較高水平。在pH為3.0時(shí)其活性明顯降低，在2.0時(shí)失去活性；在pH為13.0時(shí)，效價(jià)仍處于較高水平且明顯高于3.0，說(shuō)明噬菌體vB-EcoM-IME540具有強(qiáng)耐堿性。
圖7噬菌體vB-EcoM-IME540的pH敏感性
2.9噬菌體的耐熱穩(wěn)定性
由圖8可知，噬菌體vB-EcoM-IME540在40℃、50℃條件下作用2 h時(shí)，噬菌體效價(jià)大約下降了13.0%；60℃作用2 h，大約下降了49.0%；70℃作用20 min，效價(jià)下降了60.0%；80℃作用20 min，噬菌體失活。
圖8噬菌體vB-EcoM-IME540的耐熱穩(wěn)定性
3討論
噬菌體與其細(xì)菌宿主的進(jìn)化密切相關(guān)，并經(jīng)常提供毒力因子，使得噬菌體的研究對(duì)于理解致病株的進(jìn)化具有重要意義。本試驗(yàn)利用噬斑形成試驗(yàn)與雙層瓊脂平板培養(yǎng)法從污水中分離、純化裂解性雞大腸埃希氏菌噬菌體，并將其暫時(shí)命名為vB-EcoM-IME540，其代表意義可參考張倩等對(duì)其的解釋。
通過(guò)對(duì)噬菌體電鏡觀察、全基因組測(cè)序的比對(duì)和聚類分析知噬菌體vB-EcoM-IME540與噬菌體Enterobacteriaphage Bp7(有尾噬菌體目的肌尾噬菌體)親緣性最好，其全基因組序列覆蓋率高達(dá)97%。在國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)的最新報(bào)道中，又將此噬菌體劃分為dsDNA病毒。噬菌體vB-EcoM-IME540在pH為5.0～13.0時(shí)均有很高的活性，與孫利廣等報(bào)道的V-EcoM-C1(pH5.0～10.0)相比，具有較強(qiáng)耐堿性；在50℃內(nèi)具有穩(wěn)定的活性，70℃下40 min仍具有活性，與本實(shí)驗(yàn)室分離的噬菌體EcP5相比有一定耐高溫性；裂解范圍與王禮偉[20]分離的EcP10相比較窄，因僅對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的雞源大腸埃希氏菌進(jìn)行了裂解譜測(cè)定試驗(yàn)，而對(duì)其他種源大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌屬是否具有裂解能力尚不清楚，需要進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)加以驗(yàn)證分析。感染宿主菌的潛伏期約為20 min，暴發(fā)期時(shí)間維持約130 min，裂解量23，具有較強(qiáng)的裂解活性；在較低的最佳感染復(fù)數(shù)0.000 001時(shí)，有較高的殺菌效率。綜合以上信息，本次試驗(yàn)中分離的噬菌體vB-EcoM-IME540是一株能裂解雞大腸埃希氏菌的有尾噬菌體目肌尾噬菌體科的dsDNA噬菌體，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
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