研究簡介：有效的定殖對于微生物對其宿主發(fā)揮潛在的有毒或有益功能是必要的1。由于土壤微生物的高度多樣性和激烈競爭，快速定殖對于土壤細菌占據(jù)根部營養(yǎng)豐富的生態(tài)位非常重要。植物根際促生長細菌（PGPR）由于其多功能的植物有益特性而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。鐵在植物生長、發(fā)育和防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，也是根際中的有限資源，其中棲息的微生物爭奪這種必需的礦物質(zhì)營養(yǎng)素。植物病原體從宿主細胞中回收鐵，而植物則利用鐵保留策略來對抗病原體感染。貝萊斯芽孢桿菌SQR9是一種經(jīng)過充分研究的PGPR，它可以在根部定殖，通過促進生長和控制疾病來使植物受益。貝萊斯芽孢桿菌SQR9使用鐵載體和特定的鐵ABC轉(zhuǎn)運蛋白來獲取鐵，從而支持生物膜形成和根部定殖。為了與宿主建立相互作用，一系列與動物和植物相關(guān)的病原菌和共生細菌已經(jīng)發(fā)展出獨特的分泌系統(tǒng)，將某些蛋白質(zhì)跨膜或疏水結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到細胞外空間。在這些系統(tǒng)中，VII型分泌系統(tǒng)（T7SS）是厚壁菌門和放線菌門所獨有的。最近的研究表明，EsxA（結(jié)核分枝桿菌T7SS分泌的核心蛋白）在T7SS介導(dǎo)的毒力中發(fā)揮著核心作用，包括吞噬體膜的擾動。T7SS在芽孢桿菌屬物種15中也是保守的，其中yuk/yue操縱子編碼用于分泌YukE的T7SS，YukE與分枝桿菌中的EsxA同源。研究人員發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SQR9的T7SS及其分泌蛋白YukE導(dǎo)致植物根部鐵滲漏，這有助于貝萊斯芽孢桿菌SQR9在根部定植。研究進一步發(fā)現(xiàn)，T7SS分泌的YukE可能通過直接插入根質(zhì)膜而導(dǎo)致根部鐵滲漏。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C全自動生長曲線分析儀主要用于測量B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生長曲線。Bioscreen C系統(tǒng)通過每小時測量OD600值來監(jiān)測細菌在LB培養(yǎng)基或修改后的MSgg培養(yǎng)基中的生長情況。這種監(jiān)測是自動化的，可以連續(xù)記錄細菌的生長情況，為研究者提供了關(guān)于細菌生長動態(tài)的詳細信息。通過使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀，研究者能夠評估不同條件下（如在不同鐵濃度的培養(yǎng)基中）B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生長能力。這對于理解T7SS和YukE在細菌生長和鐵獲取中的作用至關(guān)重要，因為鐵是細菌生長的關(guān)鍵營養(yǎng)素。此外，通過比較野生型和突變株的生長曲線，研究者可以評估T7SS和YukE對細菌生長的影響。
實驗結(jié)果
T7SS和YukE對于B.velezensis SQR9在植物根部的定植至關(guān)重要。通過基因敲除實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)缺失T7SS或YukE的突變株在根部定植能力上顯著下降。YukE能夠插入植物的細胞膜，導(dǎo)致根部鐵泄漏。這種鐵泄漏在植物與SQR9的相互作用中起到了促進作用，因為鐵的可用性增加有助于SQR9的定植。提出了YukE通過直接插入植物根細胞膜來引起鐵泄漏的機制。這一過程在接種初期最為顯著，且在24小時后逐漸減弱。通過鐵染色和ICP-MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)WT SQR9處理的植物根部鐵含量顯著降低，而YukE的突變株或熱處理YukE無法復(fù)制這一效應(yīng)。在高鐵環(huán)境下，T7SS的表達和YukE的分泌增加，表明鐵水平可能通過正反饋機制調(diào)節(jié)YukE的產(chǎn)生和活性。YukE能夠引起根部鐵泄漏，但它對植物生長沒有負面影響，甚至可以增強SQR9對黃瓜生長的促進作用。揭示了貝萊森巴伯菌SQR9的T7SS及其分泌蛋白YukE導(dǎo)致植物根部鐵滲漏，從而促進貝萊森巴伯菌SQR9在根部定殖。
圖1、貝萊斯芽孢桿菌SQR9和tT7SS對根定植的貢獻。a）編碼T7SS的yuk/yue操縱子的示意圖。紅色箭頭表示編碼分泌型WXG100家族蛋白YukE的基因，綠色箭頭表示編碼輸出機制的基因。b）基于72個RNA-seq數(shù)據(jù)集的yuk/yue操縱子的轉(zhuǎn)錄相關(guān)性。計算皮爾遜相關(guān)性；顏色表示每對基因之間轉(zhuǎn)錄相關(guān)性的R值：黃色表示高相關(guān)性，藍色表示低相關(guān)性。c）培養(yǎng)物上清液和細胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡測定。d）上清液和細胞裂解液中YukE的含量。測量一份樣品的整個培養(yǎng)物、上清液和細胞裂解物，并記錄OD 600以指示細胞密度。數(shù)據(jù)以平均值±sem（n=6）表示。虛線表示5μM純化的YukE-GFP的熒光密度。e,f）WT SQR9、突變體和互補菌株在水培環(huán)境中生長的擬南芥(e)和黃瓜(f)根上的定殖。在接種后第2天測量定植的細菌細胞。
圖2、SQR9衍生菌株和YukE對植物鐵含量的影響。a）接種B.velezensis SQR9或用YukE處理的15天齡擬南芥根的Perls染色圖像。b）接種后24小時，15天齡擬南芥根部鐵的Perls染色的顯微鏡視圖。對于每次處理，檢查12個根的成熟區(qū)。c）b中Perls染色的定量分析。d–f）ICP-MS測量用YukE或SQR9衍生菌株處理的15日齡擬南芥根部在12小時(d)、24小時(e)和48小時(f)時的鐵含量。接種后P=0.815。g）通過ICP-MS測量接種后12小時，YukE梯度劑量對15日齡擬南芥根鐵含量的影響。h）接種后24小時K252a和BFA對YukE根細胞降鐵能力的影響。
圖3、YukE介導(dǎo)的根部鐵滲漏有助于SQR9的根部定殖。a）水培條件下，接種后2天，B.velezensis SQR9在15天齡的擬南芥根上定殖。b)接種后24小時，15日齡擬南芥根際細菌細胞獲得的鐵的ICP-MS測量。將野生型SQR9或突變體接種到含有常規(guī)鐵(90μM)的中等生長的15天齡擬南芥植物中。分別在接種后0小時和24小時通過劇烈洗滌和離心收集細菌細胞。細菌鐵獲取量計算為接種后24小時的鐵含量減去接種后0小時的鐵含量。c)ICP-MS測量體外細菌細胞的鐵含量。用5μM YukE處理15天的擬南芥植物12小時以防止鐵滲漏。
圖4、YukE在15天齡擬南芥細胞表面的功能和位置。a）接種或處理后24小時YukE在根表面的位置。用B.velezensis SQR9 yukE::yukE-gfp（終濃度為107個細胞/ml）接種擬南芥根，或用純化的YukE-GFP（終濃度為5μM）處理。包括對根部進行劇烈清洗步驟以去除未附著的細菌細胞和蛋白質(zhì)。b）a中所示的GFP和FM4-64信號的共定位分析。括號中的數(shù)字表示根據(jù)a中的所有重復(fù)計算得出的標準誤差。c）接種后48小時YukE在根表面的位置。比例尺，100μm。d）c中所示的GFP和FM4-64信號的共定位分析。e）接種后2天，YukE-GFP和質(zhì)膜標記PM-mCherry在本塞姆氏煙草葉細胞中的共定位。包括三個生物學(xué)重復(fù)。比例尺，100μm。該實驗重復(fù)兩次，結(jié)果相似。f）e中所示的GFP和RFP信號的共定位分析。g）YukE對PI染色根細胞核的影響。
圖5，YukE插入植物質(zhì)膜。a、b）接種后24小時，YukE變體對PI根細胞核染色(a)和鐵Perls染色(b)的影響。每幅圖像下方的分數(shù)表示細胞核被PI染色的次數(shù)。比例尺，100μm。藍色染色代表鐵。c）接種后12小時用YukE變體處理的15天齡擬南芥根部的鐵含量的ICP-OES測量。d）AlphaFold 2預(yù)測的YukE的3D結(jié)構(gòu)。黃色殘基表示用NBD標記的用于測試質(zhì)膜插入的位點。e，f，熒光共聚焦顯微鏡檢測到Y(jié)ukE在葉（e）或根（f）原生質(zhì)體上的膜插入。圖像是在混合后15小時拍攝的。每個處理包括三個重復(fù)。比例尺，20μm。該實驗重復(fù)兩次，結(jié)果相似。g,h，e(g)和f(h)中微觀視圖的定量分析。i，NBD標記的YukE變體在人工脂質(zhì)體上插入的定量分析。j，從脂質(zhì)體釋放的鐵的定量分析。
總結(jié)
本研究主要探討了植物共生菌Bacillus velezensis SQR9的VII型分泌系統(tǒng)（T7SS）及其主要分泌蛋白YukE在促進植物根部定植中的作用。研究揭示了T7SS和YukE在根際細菌與植物相互作用中的重要性，特別是在鐵這一關(guān)鍵營養(yǎng)元素的獲取和利用方面。研究發(fā)現(xiàn)YukE能夠插入植物細胞膜，導(dǎo)致根部鐵泄漏，從而為B.velezensis SQR9的定植提供有利條件。這種鐵泄漏在植物與SQR9的相互作用中起到了促進作用，因為鐵的可用性增加有助于SQR9的定植。此外研究還發(fā)現(xiàn)YukE的分泌和活性受到鐵水平的調(diào)節(jié)，表明鐵水平可能通過正反饋機制調(diào)節(jié)YukE的產(chǎn)生和活性。通過基因敲除實驗，研究者發(fā)現(xiàn)缺失T7SS或YukE的突變株在根部定植能力上顯著下降，進一步證實了T7SS和YukE在B.velezensis SQR9根部定植中的關(guān)鍵作用。此外，研究還探討了環(huán)境鐵水平對YukE分泌和T7SS表達的影響，發(fā)現(xiàn)在高鐵環(huán)境下，T7SS的表達和YukE的分泌增加。這項研究不僅增進了研究人員對植物共生菌如何通過T7SS和YukE與植物相互作用的理解，而且對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物健康具有潛在的應(yīng)用價值。在本論文研究過程中，Bioscreen C全自動生長曲線分析儀的使用為研究提供了一個高效且準確的方法來監(jiān)測細菌生長，這對于理解細菌與植物相互作用的分子機制以及開發(fā)潛在的農(nóng)業(yè)應(yīng)用具有重要意義。通過這種分析，研究者可以更好地理解T7SS和YukE在植物共生菌與植物相互作用中的作用，以及它們?nèi)绾斡绊懼参锏蔫F營養(yǎng)和根部微生物相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)還有助于研究人員更好地理解植物根部微生物群落的動態(tài)變化，為根際工程和植物微生物組研究提供了新的視角。
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