現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依靠抗生素通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)來(lái)治療細(xì)菌感染。一旦進(jìn)入這些細(xì)胞，抗生素就會(huì)與特定酶靶標(biāo)上的某些位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止細(xì)菌生長(zhǎng)。編碼這些靶標(biāo)的基因會(huì)自然發(fā)生隨機(jī)變化（突變），在某些情況下會(huì)使抗生素難以附著在靶標(biāo)上，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。因此，隨著時(shí)間的推移，抗生素使用得越多，細(xì)菌種群進(jìn)化出對(duì)現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生耐藥性的突變體的可能性就越大，人們就越迫切地需要新的方法來(lái)防止抗生素治療過(guò)時(shí)。幾十年來(lái)科學(xué)家們一直在研究耐藥性突變，希望通過(guò)相關(guān)機(jī)制來(lái)指導(dǎo)設(shè)計(jì)克服耐藥性的新療法。然而，這種努力一直受到限制，因?yàn)樽匀话l(fā)生的耐藥性突變只占可能發(fā)生的突變（完整的突變空間）的一小部分，而且迄今為止，大多數(shù)藥物結(jié)合位點(diǎn)突變都被忽視了。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，來(lái)自美國(guó)紐約大學(xué)格羅斯曼醫(yī)學(xué)院的研究人員應(yīng)用了一種名為多重自動(dòng)化基因組工程（Multiplex Automated Genome Engineering，MAGE）的技術(shù)產(chǎn)生了大腸桿菌中涉及抗生素利福平（rifampicin）結(jié)合的RNA聚合酶（RNAP）的全部突變清單，其中在這種細(xì)菌中，利福平附著在它的RNAP上并使其失效。研究人員利用自然界中存在的20種氨基酸的每一種分別替換了構(gòu)成大腸桿菌利福平結(jié)合位點(diǎn)的38個(gè)氨基酸殘基，從而制造出了760種獨(dú)特的RNAP突變體。他們?nèi)缓笤诎ɡＦ教幚碓趦?nèi)的不同條件下測(cè)試了這系列突變體的生長(zhǎng)情況。這些發(fā)現(xiàn)L521Y和T525D這兩種突變體對(duì)利福平非常敏感。這種抗生素不僅能阻止這些突變體生長(zhǎng)，還能幾乎消滅這兩種突變細(xì)菌種群。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen用于監(jiān)測(cè)不同突變體在利福平（Rifampicin）處理下的生長(zhǎng)恢復(fù)情況。通過(guò)設(shè)置不同的時(shí)間點(diǎn)和處理?xiàng)l件，能夠詳細(xì)觀察突變體在藥物處理后的生長(zhǎng)延遲和恢復(fù)情況。由于Bioscreen可以同時(shí)檢測(cè)3個(gè)不同波長(zhǎng)的OD值變化。這不僅能夠監(jiān)測(cè)微生物的生長(zhǎng)曲線，還可以同時(shí)檢測(cè)其他相關(guān)物質(zhì)的生成或降解動(dòng)態(tài)變化曲線。除了監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)，Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀還可以同時(shí)檢測(cè)抗生素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。Bioscreen能夠在15°C至65.0°C的范圍內(nèi)精確控制培養(yǎng)溫度，且溫度變化的精度可達(dá)0.1°C。這使得研究者能夠在不同的溫度條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估溫度對(duì)突變體生長(zhǎng)的影響。在本研究中還用于評(píng)估不同溫度下快速RNAP突變體的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，這些突變體在低溫下生長(zhǎng)更快，且在25°C時(shí)達(dá)到更高的OD值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
研究者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)α螺旋區(qū)域（rpoB 521-526），其中的突變可以顯著增強(qiáng)或破壞利福平的結(jié)合。在這個(gè)區(qū)域，他們發(fā)現(xiàn)了單氨基酸突變體，這些突變體通過(guò)增加利福平的結(jié)合親和力，將利福平從抑菌劑轉(zhuǎn)變?yōu)闅⒕鷦ㄟ^(guò)誘導(dǎo)致命的DNA斷裂實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變。這些致命的DNA斷裂是復(fù)制依賴的，表明利福平通過(guò)在啟動(dòng)子處引起有害的轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突來(lái)殺死細(xì)菌。發(fā)現(xiàn)了其他結(jié)合位點(diǎn)突變，這些突變大大增加了RNAP的速度?？焖俚腞NAP耗盡細(xì)胞中的核苷酸，改變了細(xì)胞對(duì)不同抗生素的敏感性，并在低溫下提供了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。通過(guò)映射自然rpoB序列多樣性，研究者發(fā)現(xiàn)，改變RNAP屬性或賦予藥物抗性的功能性利福平結(jié)合位點(diǎn)突變?cè)谧匀唤缰蓄l繁發(fā)生。一些對(duì)利福平超敏感的突變體，這些突變體在利福平存在下生長(zhǎng)受到抑制，并且在DNA損傷修復(fù)突變體中對(duì)利福平的敏感性增加。這些RifHS突變體在利福平處理后顯示出更高的DNA斷裂水平，并且在缺乏雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)機(jī)制的細(xì)胞中，利福平的殺菌效果增強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)了一些快速RNAP突變體，這些突變體對(duì)5-氟尿嘧啶（5FU）和雙環(huán)霉素（BCM）敏感。這些突變體的RNAP具有更高的轉(zhuǎn)錄延伸速率和更低的暫停頻率，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核苷酸池的耗竭，從而增加了對(duì)靶向核苷酸生物合成的抗生素的敏感性。
圖1、在Rif結(jié)合位點(diǎn)生成所有單個(gè)密碼子替換。a，大腸桿菌RNAP的rpoB亞基內(nèi)的Rif結(jié)合位點(diǎn)（藍(lán)色），在下圖中放大（PDB 5UAC）。b，突變池生成的示意圖。MAGE寡核苷酸設(shè)計(jì)為在Rif結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)生成760個(gè)單密碼子突變體（20個(gè)取代×38個(gè)位點(diǎn)）的飽和庫(kù)。c，適應(yīng)性篩選后在時(shí)間點(diǎn)0（T0）和時(shí)間點(diǎn)1（T1）生成的突變豐度的代表性熱圖。對(duì)于篩選數(shù)據(jù)的分析，通過(guò)計(jì)算log2（T1 fitness/T0）倍數(shù)變化，在T1和T0之間進(jìn)行歸一化。行對(duì)應(yīng)于rpoB位置510–537和563–572;列對(duì)應(yīng)于氨基酸。白色方塊表示野生型殘基。d，藥物敏感性和耐藥性篩選示意圖。在LB中無(wú)法生長(zhǎng)的突變體被指定為弱突變體，而僅在藥物中無(wú)法生長(zhǎng)的突變體被認(rèn)為對(duì)藥物敏感。通過(guò)將“T1藥物”突變豐度標(biāo)準(zhǔn)化為“T1適應(yīng)性”，即log2（T1藥物/T1適應(yīng)性），可以分離藥物特異性作用。
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