蘋果酸乳酸發(fā)酵(MLF)是一種由乳酸菌(LAB)將l-蘋果酸轉(zhuǎn)化為l-乳酸的生物過(guò)程，在大多數(shù)紅酒和一些白葡萄酒中是非?？扇〉?。這種轉(zhuǎn)化導(dǎo)致葡萄酒的脫酸、微生物穩(wěn)定和香氣修飾。與釀酒酵母進(jìn)行的酒精發(fā)酵(AF)不同，MLF是不確定的，可能由于惡劣環(huán)境，如低pH值、高乙醇和SO2。延長(zhǎng)釀酒時(shí)間可能會(huì)降低釀酒廠的產(chǎn)量，并增加腐敗微生物(尤其是酒香型酵母菌屬)產(chǎn)生異味的風(fēng)險(xiǎn)。因此，高效可靠的MLF對(duì)葡萄酒的微生物穩(wěn)定性和感官品質(zhì)至關(guān)重要。在LAB物種中，葡萄酒酒球菌(Oenococcus oeniis)是在葡萄酒壓力條件下最適應(yīng)的物種，因此在MLF中占主導(dǎo)地位。酒酵素通過(guò)蘋果酸和檸檬酸代謝產(chǎn)生乙酸、乳酸、乙酮和2,3-丁二醇，從而影響葡萄酒的香氣。因此，選擇酵母/細(xì)菌菌株對(duì)是確保高效和可靠的MLF的關(guān)鍵。在過(guò)去的幾十年里，人們對(duì)改善葡萄酒香氣的復(fù)雜性越來(lái)越感興趣，越來(lái)越多地使用非釀酒酵母作為發(fā)酵劑來(lái)進(jìn)行AF。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對(duì)共接種菌體中葡萄酒酒球菌的生長(zhǎng)和活性有積極作用。在混合發(fā)酵中，非酵母菌可以刺激、抑制或不影響MLF，這取決于菌株和接種時(shí)機(jī)。因此，更深入地了解在同時(shí)和連續(xù)接種酵母發(fā)酵劑培養(yǎng)過(guò)程中，葡萄酒酒球菌的活力和香氣結(jié)果對(duì)管理MLF是非常必要的。
本研究旨在探討兩個(gè)關(guān)鍵因素（接種時(shí)間和配對(duì)酵母）對(duì)梅洛葡萄酒發(fā)酵性能和香氣產(chǎn)生的影響。對(duì)發(fā)酵活性和微生物生長(zhǎng)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。測(cè)定了最終葡萄酒的非揮發(fā)物、揮發(fā)物和香氣特征。此外，研究了接種時(shí)間和酵母配對(duì)兩種試驗(yàn)因素及其相互作用對(duì)葡萄酒酒球菌生長(zhǎng)和香氣產(chǎn)生的影響。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
為了模擬梅洛必須發(fā)酵的應(yīng)激條件葡萄酒酒球菌SD-2a分別在酸脅迫(pH值3.5無(wú)乙醇)和乙醇脅迫(pH值4.8 12%v/v乙醇)的ATB肉湯中培養(yǎng)。使用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(FP-1100-C,Finland)在線監(jiān)測(cè)OD600 nm下細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。將微生物(OD600 nm=1.0)接種到接種量為2%v/v的脅迫ATB培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移到多孔板(400μL)，在28°C下培養(yǎng)56 h。每2 h測(cè)量一次OD600 nm值，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行5個(gè)重復(fù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
接種時(shí)機(jī)和配對(duì)酵母對(duì)梅洛葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中葡萄酒酒球菌SD-2a、釀酒酵母F5和發(fā)酵酵母H5Y-28的發(fā)酵效果有顯著影響。共同接種使高效釀酒可能是由于較低的乙醇脅迫，而順序接種獲得了與酵母和葡萄衍生揮發(fā)物相關(guān)的更大的香氣結(jié)果。總釀酒時(shí)間由接種時(shí)間決定，而不是由配對(duì)酵母決定。然而發(fā)酵性絲孢酵母的存在，無(wú)論是活的還是死的，都刺激了葡萄酒酒球菌SD-2a的生長(zhǎng)，這表明它是誘導(dǎo)可靠的葡萄酒MLF的潛在候選人。需要進(jìn)一步的研究以闡明代謝產(chǎn)物(如甘露糖蛋白)，發(fā)酵性絲孢酵母H5Y-28促進(jìn)了葡萄酒酒球菌的活力和MLF活性。此外，為了確定所觀察到的影響是菌株特異性的還是種特異性的，應(yīng)該進(jìn)一步研究廣泛的發(fā)酵假單胞菌菌株。
圖1、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。(A)AF期間的糖消耗:co-OS和co-OSP分別等于se-OS和se-OSP。(B)co-OS、co-OSP同步發(fā)酵和(C)se-OS、se-OSP順序發(fā)酵中的蘋果酸(實(shí)線)和乳酸(虛線)濃度。
圖2、微生物的增長(zhǎng)。(A)在AF期間釀酒酵母(實(shí)線)和發(fā)酵性絲孢酵母(虛線)。(B)在AF和MLF期間葡萄酒酒球菌SD-2a。(C)葡萄酒酒球菌SD-2a在pH 3.4和12%v/v乙醇下。
圖3、梅洛葡萄酒中與O.oeni代謝相關(guān)的主要有機(jī)酸的濃度。(A)蘋果酸和檸檬酸。(B)乳酸和乙酸。
圖4、從MLF中提取的梅洛葡萄酒揮發(fā)物的熱圖和層次聚類分析。*香氣活性揮發(fā)性物質(zhì)(濃度超過(guò)香氣閾值的揮發(fā)性物質(zhì))。
圖5、梅洛葡萄酒的香氣特征和MF值。
總結(jié)
人們對(duì)開發(fā)葡萄酒球菌和釀酒酵母菌/非釀酒酵母菌的共接種物，用于葡萄酒的蘋果乳酸發(fā)酵(MLF)和酒精發(fā)酵(AF)越來(lái)越感興趣。本研究借助Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，闡明兩個(gè)關(guān)鍵因素(接種時(shí)機(jī)和酵母配對(duì))對(duì)梅洛葡萄酒發(fā)酵性能和香氣產(chǎn)生的影響。
用于MLF的葡萄酒酒球菌與用于AF的兩種酵母培養(yǎng)物(即單一釀酒酵母和混合釀酒酵母/發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28同時(shí)或順序接種。接種時(shí)間決定了總體釀酒時(shí)間，并影響了主要高等醇、萜和葡萄酒酒球菌介導(dǎo)的揮發(fā)物的產(chǎn)生。與之相比，配對(duì)酵母菌提高了大頭翁的活力，對(duì)芳香酯類和揮發(fā)性脂肪酸有顯著影響。可能是由于較低的乙醇脅迫，共接種允許葡萄酒酒球菌在AF（酒精發(fā)酵）期間啟動(dòng)MLF，導(dǎo)致總發(fā)酵時(shí)間減少45%。與此同時(shí)，發(fā)酵性絲孢酵母促進(jìn)了葡萄酒酒球菌的生長(zhǎng)，其最大數(shù)量是無(wú)發(fā)酵型絲孢酵母共發(fā)酵的1.7倍。這種對(duì)葡萄酒酒球菌生長(zhǎng)的刺激也發(fā)生在連續(xù)發(fā)酵中，發(fā)酵性絲孢酵母被釀酒酵母取代。只有在順序接種條件下，發(fā)酵假單胞菌能誘導(dǎo)高水平的3-甲基乙酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，從而增強(qiáng)葡萄酒的鮮果性。這些結(jié)果表明，發(fā)酵發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28對(duì)葡萄酒球菌和MLF有積極作用。本研究提供了一種利用友好的非酵母菌和適當(dāng)?shù)慕臃N策略來(lái)提高葡萄酒MLF和香氣結(jié)果的替代方法。
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