2結(jié)果與分析
2.1菌株形態(tài)學(xué)分析
在MRS培養(yǎng)基中分離出多株乳酸菌，將其中一株菌株命名為ZJBF005，進(jìn)行后續(xù)分析與鑒定。菌落呈乳白色、圓形、不透明狀，大而平坦，表面光滑，邊緣整齊(圖1)。菌株ZJBF005為直或微彎桿狀、兩端鈍圓、單個(gè)或成對(duì)存在、無(wú)芽孢的革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌。
圖1菌株ZJBF005的菌落形態(tài)(左)及細(xì)胞形態(tài)(右，1 000×)
2.2菌株同源比對(duì)分析
基于16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果，以酒類酒球菌(Oenococcus oeni)JCM 6125(AB022924.1)為外枝構(gòu)建菌株ZJBF005的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。由16S rRNA基因測(cè)序BLAST結(jié)果得知，菌株ZJBF005與唾液乳桿菌之間的成對(duì)序列相似度高達(dá)99.52%，因此確定菌株ZJBF005為唾液乳桿菌。
圖2菌株ZJBF005系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Lactobacillus aviarius subsp.araffinosus DSM 20653(AYYZ01000003):鳥(niǎo)乳桿菌不解棉籽糖亞種DSM 20653(AYYZ01000003);Lactobacillus aviarius subsp.aviarius DSM 20655(AYZA01000007):鳥(niǎo)乳桿菌鳥(niǎo)亞種DSM 20655(AYZA01000007);Lactobacillus hayakitensis JCM 14209(BAML0100063):早來(lái)乳桿菌JCM 14209(BAML0100063);Lactobacillus salivarius BCRC 14759(CP024067):唾液乳桿菌BCRC 14759(CP024067)。
2.3菌株生理生化特性
對(duì)菌株ZJBF005進(jìn)行生理生化特性鑒定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，菌株ZJBF005可利用單糖(甘露糖、山梨糖、半乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、葡萄糖等)、二糖(纖維二糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖等)和多糖(棉子糖等)產(chǎn)酸。硫化氫試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)等結(jié)果均為陰性，V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，此外菌株ZJBF005具有運(yùn)動(dòng)性。試驗(yàn)結(jié)果參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株ZJBF005生理生化特性與唾液乳桿菌相符。
表2菌株ZJBF005的生理生化特性
2.4菌株適宜生長(zhǎng)溫度
對(duì)在20、25、30、35、37、40和45℃環(huán)境下生長(zhǎng)的唾液乳桿菌ZJBF005進(jìn)行OD600值測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。唾液乳桿菌ZJBF005在20~45℃條件下皆可生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)溫度為37℃，其最大OD600值可達(dá)1.7。接種2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至25 h后進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。
圖3唾液乳桿菌ZJBF005不同溫度下的生長(zhǎng)曲線
2.5菌株產(chǎn)酸及耐酸特性
由圖4可知，唾液乳桿菌ZJBF005在MRS培養(yǎng)液中迅速產(chǎn)酸，6 h內(nèi)pH從5.97下降至3.28，此階段對(duì)應(yīng)該菌株的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期;6~24 h內(nèi)培養(yǎng)液pH略微降低，直至穩(wěn)定在3.14。唾液乳桿菌ZJBF005的菌體數(shù)量隨著pH的升高而增加，在pH為1和2的培養(yǎng)液中無(wú)法生長(zhǎng);在pH為3的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)緩慢;當(dāng)pH提高為4或者更高時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度明顯加快，菌體在pH為7的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最佳。
圖4唾液乳桿菌ZJBF005的產(chǎn)酸(左)及耐酸曲線(右)
2.6菌株對(duì)人工胃液和人工腸液的耐受特性
由表3可知，經(jīng)3 h人工胃液培養(yǎng)后，唾液乳桿菌ZJBF005活菌數(shù)從8.39 lg(CFU/mL)降至3.44 lg(CFU/mL)，存活率為(40.96±0.21)%。經(jīng)3 h人工腸液培養(yǎng)后，唾液乳桿菌ZJBF005活菌數(shù)從8.23 lg(CFU/mL)降至7.14 lg(CFU/mL)，存活率為(86.70±0.14)%。
表3唾液乳桿菌ZJBF005在人工胃液和人工腸液中的存活率
2.7菌株對(duì)膽鹽的耐受特性
由圖5可知，對(duì)唾液乳桿菌ZJBF005進(jìn)行膽鹽耐受性試驗(yàn)，在無(wú)膽鹽培養(yǎng)基中菌體正常生長(zhǎng);在含有0.1%和0.2%的膽鹽條件下培養(yǎng)至3 h時(shí)生長(zhǎng)較為良好，隨時(shí)間的推移菌體在0.2%的膽鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，而在含有0.1%的膽鹽環(huán)境下還可以緩慢生長(zhǎng);當(dāng)膽鹽濃度超過(guò)0.3%時(shí)，菌體幾乎不能生長(zhǎng)。
圖5唾液乳桿菌ZJBF005的膽鹽耐受性
2.8菌株對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑制作用
由表4可知，通過(guò)牛津杯法抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除大腸桿菌外，唾液乳桿菌ZJBF005對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均具有生長(zhǎng)抑制作用。唾液乳桿菌ZJBF005對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制程度相同，抑菌圈直徑分別為(14±1)mm和(13±1)mm。
表4唾液乳桿菌ZJBF005抑菌試驗(yàn)結(jié)果
抑菌程度用抑菌圈大小表示，+++、++和+分別表示抑菌圈大小為23~30 mm、16~23 mm和9~16 mm，-表示無(wú)抑菌圈。下表同。The inhibition zone diameter shows the bacteriostatic level，+++，++and+represent the inhibition zone diameter 23 to 30 mm，16 to 23 mm和9 to 16 mm，respectively，-was no inhibition zone.The same as below。
2.9菌株的抗生素敏感性
由表5可知，利用紙片擴(kuò)散法測(cè)定唾液乳桿菌ZJBF005對(duì)12種抗生素的耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌ZJBF005對(duì)青霉素G、氯霉素、頭孢孟多、克林霉素、環(huán)丙沙星等抗生素敏感;而對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素、磷霉素、阿奇霉素、甲氧芐啶和甲硝唑等抗生素不敏感。
表5唾液乳桿菌ZJBF005抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果
2.10動(dòng)物安全性試驗(yàn)
動(dòng)物安全性試驗(yàn)期間，2組之間小鼠體重?zé)o顯著差異，無(wú)生病或者死亡;剖檢后觀察其內(nèi)臟均無(wú)出血現(xiàn)象，肝臟、脾臟均無(wú)眼觀病變。這表明唾液乳桿菌ZJBF005對(duì)小鼠無(wú)毒副作用。
相關(guān)新聞推薦
1、中草藥大青葉對(duì)酒曲發(fā)酵過(guò)程酒曲理化參數(shù)及微生物活性的影響（一）
2、直流電刺激對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)過(guò)程的作用研究
3、安靜型犬與活潑型犬腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異研究（二）