本次研究以大青葉作為輔料，探討添加大青葉對(duì)酒曲發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，添加大青葉使培養(yǎng)基質(zhì)密度降低、基質(zhì)疏松，有利于發(fā)酵過程的通氣和傳熱，發(fā)酵后酸度下降。添加大青葉促進(jìn)酒曲中霉菌的生長(zhǎng)，但抑制細(xì)菌和酵母生長(zhǎng)，并導(dǎo)致生物活性發(fā)生變化，影響效果與大青葉的添加量成正比，當(dāng)添加量為9%時(shí)，糖化酶酶活提高4.24倍，液化酶活、發(fā)酵力、酯化力等分別下降30%、90%和80%。同時(shí)，添加大青葉使酒曲成品的揮發(fā)性成分明顯增多，酯類物質(zhì)從4種增加至8種，還增加了苯甲醇和多種高級(jí)脂肪酸、烷烴、烯烴、酰胺、醇等物質(zhì)，這些新增物質(zhì)將會(huì)對(duì)酒曲風(fēng)味產(chǎn)生較大影響。
酒曲作為酒釀造過程中的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，其質(zhì)量的好壞對(duì)酒的風(fēng)味、產(chǎn)率和品質(zhì)具有極大的影響。傳統(tǒng)酒曲制作多添加中草藥作為輔料（如桑葉、野蓼等），少的添加1種，多的甚至上百種。添加方法有破碎后直接添加或熱水浸煮后取浸提液添加。添加的中草藥為酒曲提供植物中的微生物、蛋白質(zhì)、芳香成分及有毒（抑菌）成分，但對(duì)于添加中草藥在酒曲制作過程中的作用機(jī)理少見報(bào)道。
大青葉是我國(guó)是傳統(tǒng)的清熱解毒中草藥，具有抗病毒、抗內(nèi)毒素和抑菌活性，臨床主要用于流行性感冒、急性傳染性肝炎、痢疾、急性腸胃炎、發(fā)斑發(fā)疹等疾病。以往對(duì)大青葉的研究主要在醫(yī)藥和化學(xué)成分上，還沒有應(yīng)用于酒曲的研究發(fā)表。大青葉主要含有生物堿、有機(jī)酸、苷類、甾醇等幾大類化合物，其揮發(fā)油成分主要有棕櫚酸、植酮、苯甲醇以及正二十九烷等烷烴類物質(zhì)。
本研究以某酒廠酒曲中的一種添加植物——大青葉作為研究對(duì)象，探討添加中草藥對(duì)酒曲發(fā)酵過程酒曲理化參數(shù)及微生物活性的影響，為酒曲添加中草藥輔料的生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
大青葉、餅丸（含釀酒酵母、產(chǎn)酯酵母、米根霉、毛霉、華根霉、乳酸菌、醋酸菌等微生物，常溫保藏）：廣東省九江酒廠有限公司；大米、黃豆等：市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、可溶性淀粉、葡萄糖、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、硫酸鎂等（化學(xué)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚（色譜純）、乙醇（分析純）、己酸乙酯（分析純）、乙酸正戊酯（分析純）：上海泰坦科技股份有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用分析儀：美國(guó)安捷倫公司；GC-2014C氣相色譜分析儀：日本島津公司ZDJ-4A自動(dòng)電位滴定儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BIOSCREEN C PRO全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀；UV-2802SH紫外分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。
1.3方法
1.3.1酒曲培養(yǎng)基制備
參考酒廠酒曲制作工藝，以大米和黃豆為主料，兩者質(zhì)量比為8∶2，分別按照1∶1加水、蒸煮30 m in、冷卻至35℃左右后混合，同時(shí)加入大青葉（粉碎度為1 cm左右）0、4.5%、9%和餅丸（1.5%），于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（35℃、相對(duì)濕度85%）培養(yǎng)6 d。發(fā)酵過程中需定時(shí)噴灑霧狀水以保持酒曲含水量。每隔2 d取樣分析。
1.3.2酒曲揮發(fā)性成分提取
將酒曲置于索氏提取管中。量取150 m L石油醚溶劑于250 m L圓底燒瓶?jī)?nèi)，置于85℃的恒溫水浴鍋中6 h，取樣，20 000 r/min離心15s，上清液（揮發(fā)油）置于樣瓶中，待測(cè)。
1.3.3測(cè)定方法
酒曲發(fā)酵樣品的糖化酶酶活、液化酶酶活、酯化力、含水量、酸度、密度的測(cè)定依照參考文獻(xiàn)。
發(fā)酵力測(cè)定采用排飽和碳酸鈉溶液收集CO2的方法。酒曲微生物測(cè)定：采用稀釋平板計(jì)數(shù)法。
揮發(fā)性成分（揮發(fā)油）分析方法：揮發(fā)油溶解于適量的石油醚，采用GC-MS進(jìn)行分析。色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)柱管（30 m×0.25 mm，0.25μm）；升溫程序：50℃保留3 m in，4℃/m in升溫至230℃后，保持30 m in；進(jìn)樣量為1μL；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為氦氣，流速2 m L/min。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃；電子倍增器電壓1 858.8 V；掃描質(zhì)量范圍35～350 m/z。在HP-5MS柱上使用一系列同源性C8-C25正烷烴對(duì)所有揮發(fā)成分進(jìn)行標(biāo)定分析，并通過美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步確認(rèn)。各組分相關(guān)濃度通過峰面積歸一化法計(jì)算求出各化合物的峰面積相對(duì)含量。
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