2.2沒食子酸對腐敗希瓦氏菌生長曲線和殺菌曲線的影響
腐敗希瓦氏菌的生長曲線見圖1(a)，整個培養(yǎng)期，對照組的腐敗希瓦氏菌菌數(shù)呈逐漸增長趨勢，經(jīng)歷了延滯期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期。而1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理組沒有明顯增長的趨勢，不能進入對數(shù)生長期。表明在此濃度下，腐敗希瓦氏菌的生長被完全抑制。時間殺菌曲線如圖1(b)所示，腐敗希瓦氏菌培養(yǎng)過程中，對照組活菌數(shù)呈明顯的上升趨勢，經(jīng)歷了延滯期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期，與生長曲線一致。沒食子酸處理組的活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，表明此濃度下的沒食子酸具有一定殺菌活性。結(jié)合生長曲線與殺菌曲線可說明，沒食子酸在1.25 mg/mL(MIC)濃度下，活菌數(shù)量逐漸減少，能完全抑制腐敗希瓦氏菌的生長。
圖1食子酸對腐敗希瓦氏菌的生長曲線和時間殺菌曲線
2.3沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞形態(tài)的影響
通過SEM觀察1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理前后腐敗希瓦氏菌細胞的形態(tài)變化。如圖2(a)所示，對照組的腐敗希瓦氏菌菌體完整飽滿，菌體表面沒有破損。而經(jīng)沒食子酸[圖2(b)]處理細菌形貌發(fā)生變化，細胞破裂，扭曲變形，一些部位開始凹陷。可能是細胞膜破損造成細胞內(nèi)容物的大量泄露，從而使細胞明顯變形，粘連在一起。結(jié)果表明，沒食子酸可引起腐敗希瓦氏菌細胞的破損和變形，嚴重影響細胞正常生長，甚至造成細胞死亡。沒食子酸分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基可能是其產(chǎn)生抑菌作用的活性基團，與細菌細胞膜上的蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生反應，改變細菌細胞膜通透性，從而破壞細胞膜的完整性，導致細菌細胞形變。
圖2沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞形態(tài)的影響
2.4沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞凋亡的影響
流式細胞圖分為4個區(qū)域，LL區(qū)為細胞存活，LR區(qū)為早期凋亡，UR區(qū)為晚期凋亡，UL區(qū)為細胞壞死。圖3(a)為對照組流式細胞分析結(jié)果，LL區(qū)細胞存活率高達96.1%，細胞壞死率為2.5%，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.6%和0.8%。由此可見，未經(jīng)處理的細菌存活率非常高。經(jīng)MIC沒食子酸[圖3(b)]處理的腐敗希瓦氏菌，存活率達到78.6%，細胞壞死率為20.8%，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.0%，0.6%，壞死率顯著高于對照組。較對照組相比，經(jīng)沒食子酸作用后的腐敗希瓦氏菌的凋亡率明顯增大，可能是沒食子酸能夠破壞細胞壁膜結(jié)構(gòu)，使細胞膜通透性增大。
圖3沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞凋亡的影響
2.5沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞膜完整性的影響
經(jīng)沒食子酸處理的腐敗希瓦氏菌細胞中蛋白及核酸泄漏情況用于反映細菌細胞膜完整性的變化。圖4(a)是1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理的腐敗希瓦氏菌菌懸液在260 nm下的吸光值。對照組的OD260 nm為0.526，經(jīng)沒食子酸處理后的腐敗希瓦氏菌菌懸液的OD260 nm達到1.024，顯著高于對照組，表明沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌核酸的外泄。對照組腐敗希瓦氏菌菌懸液中總蛋白濃度為3.689 mg/mL，沒食子酸處理后的蛋白濃度明顯增加至15.841 mg/mL，表明沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌蛋白的外泄。以上結(jié)果說明腐敗希瓦氏菌的膜結(jié)構(gòu)被破壞，導致細胞的內(nèi)容物滲漏，進一步影響了菌體的代謝與生長。這可能是因為沒食子酸具有較強的抗氧化性能，酚羥基能夠提供質(zhì)子，直接吸附于細胞，打破菌體原有的保護屏障，從而導致胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏增加。
圖4沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞完整性的影響
圖5沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性的影響
2.6沒食子酸對腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性的影響
測定1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理對腐敗希瓦氏菌菌懸液電導率的變化，進而分析對細胞膜通透性的影響(圖5)。前60 min，各組電導率均有所增加，對照組電導率從13.46 mS/cm升至15.32 mS/cm，沒食子酸處理組腐敗希瓦氏菌菌懸液電導率從13.46 mS/cm迅速增加至16.91 mS/cm，其電導率顯著高于對照組。60 min后，隨著時間的延長，各組電導率趨于穩(wěn)定。這一趨勢與Li等的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的電導率在培養(yǎng)前45 min下顯著增加。結(jié)果表明，沒食子酸處理使菌體的細胞膜通透性增加，導致胞內(nèi)大量的電解質(zhì)泄露至培養(yǎng)液中，電導率增加，這會影響其正常代謝，最終導致死亡。
3結(jié)論
沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對腐敗希瓦氏菌均具有較好的抑制作用，其中沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的抑制作用更強，其最小抑菌濃度為1.25 mg/mL。1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌細胞形態(tài)的改變，細胞膜完整性破壞，細胞膜通透性增大，核酸、蛋白質(zhì)等大分子大量泄漏，致使細菌細胞凋亡率增加。沒食子酸是一種具有潛在應用前景的水產(chǎn)品保鮮劑，后續(xù)研究可考慮探究沒食子酸在水產(chǎn)品保鮮中的應用。
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