2.2沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)曲線和殺菌曲線的影響


腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)曲線見圖1(a)，整個(gè)培養(yǎng)期，對(duì)照組的腐敗希瓦氏菌菌數(shù)呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，經(jīng)歷了延滯期、指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。而1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理組沒有明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)，不能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。表明在此濃度下，腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)被完全抑制。時(shí)間殺菌曲線如圖1(b)所示，腐敗希瓦氏菌培養(yǎng)過程中，對(duì)照組活菌數(shù)呈明顯的上升趨勢(shì)，經(jīng)歷了延滯期、指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，與生長(zhǎng)曲線一致。沒食子酸處理組的活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明此濃度下的沒食子酸具有一定殺菌活性。結(jié)合生長(zhǎng)曲線與殺菌曲線可說明，沒食子酸在1.25 mg/mL(MIC)濃度下，活菌數(shù)量逐漸減少，能完全抑制腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)。

圖1食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)曲線和時(shí)間殺菌曲線


2.3沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響


通過SEM觀察1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理前后腐敗希瓦氏菌細(xì)胞的形態(tài)變化。如圖2(a)所示，對(duì)照組的腐敗希瓦氏菌菌體完整飽滿，菌體表面沒有破損。而經(jīng)沒食子酸[圖2(b)]處理細(xì)菌形貌發(fā)生變化，細(xì)胞破裂，扭曲變形，一些部位開始凹陷?？赡苁羌?xì)胞膜破損造成細(xì)胞內(nèi)容物的大量泄露，從而使細(xì)胞明顯變形，粘連在一起。結(jié)果表明，沒食子酸可引起腐敗希瓦氏菌細(xì)胞的破損和變形，嚴(yán)重影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。沒食子酸分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基可能是其產(chǎn)生抑菌作用的活性基團(tuán)，與細(xì)菌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生反應(yīng)，改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞形變。

圖2沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響


2.4沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞凋亡的影響


流式細(xì)胞圖分為4個(gè)區(qū)域，LL區(qū)為細(xì)胞存活，LR區(qū)為早期凋亡，UR區(qū)為晚期凋亡，UL區(qū)為細(xì)胞壞死。圖3(a)為對(duì)照組流式細(xì)胞分析結(jié)果，LL區(qū)細(xì)胞存活率高達(dá)96.1%，細(xì)胞壞死率為2.5%，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.6%和0.8%。由此可見，未經(jīng)處理的細(xì)菌存活率非常高。經(jīng)MIC沒食子酸[圖3(b)]處理的腐敗希瓦氏菌，存活率達(dá)到78.6%，細(xì)胞壞死率為20.8%，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為0.0%，0.6%，壞死率顯著高于對(duì)照組。較對(duì)照組相比，經(jīng)沒食子酸作用后的腐敗希瓦氏菌的凋亡率明顯增大，可能是沒食子酸能夠破壞細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜通透性增大。

圖3沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞凋亡的影響


2.5沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜完整性的影響


經(jīng)沒食子酸處理的腐敗希瓦氏菌細(xì)胞中蛋白及核酸泄漏情況用于反映細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的變化。圖4(a)是1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理的腐敗希瓦氏菌菌懸液在260 nm下的吸光值。對(duì)照組的OD260 nm為0.526，經(jīng)沒食子酸處理后的腐敗希瓦氏菌菌懸液的OD260 nm達(dá)到1.024，顯著高于對(duì)照組，表明沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌核酸的外泄。對(duì)照組腐敗希瓦氏菌菌懸液中總蛋白濃度為3.689 mg/mL，沒食子酸處理后的蛋白濃度明顯增加至15.841 mg/mL，表明沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌蛋白的外泄。以上結(jié)果說明腐敗希瓦氏菌的膜結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)容物滲漏，進(jìn)一步影響了菌體的代謝與生長(zhǎng)。這可能是因?yàn)闆]食子酸具有較強(qiáng)的抗氧化性能，酚羥基能夠提供質(zhì)子，直接吸附于細(xì)胞，打破菌體原有的保護(hù)屏障，從而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏增加。

圖4沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞完整性的影響

圖5沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜通透性的影響


2.6沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜通透性的影響


測(cè)定1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理對(duì)腐敗希瓦氏菌菌懸液電導(dǎo)率的變化，進(jìn)而分析對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響(圖5)。前60 min，各組電導(dǎo)率均有所增加，對(duì)照組電導(dǎo)率從13.46 mS/cm升至15.32 mS/cm，沒食子酸處理組腐敗希瓦氏菌菌懸液電導(dǎo)率從13.46 mS/cm迅速增加至16.91 mS/cm，其電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組。60 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組電導(dǎo)率趨于穩(wěn)定。這一趨勢(shì)與Li等的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的電導(dǎo)率在培養(yǎng)前45 min下顯著增加。結(jié)果表明，沒食子酸處理使菌體的細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)大量的電解質(zhì)泄露至培養(yǎng)液中，電導(dǎo)率增加，這會(huì)影響其正常代謝，最終導(dǎo)致死亡。


3結(jié)論


沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對(duì)腐敗希瓦氏菌均具有較好的抑制作用，其中沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑制作用更強(qiáng)，其最小抑菌濃度為1.25 mg/mL。1.25 mg/mL(MIC)沒食子酸處理引起腐敗希瓦氏菌細(xì)胞形態(tài)的改變，細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞膜通透性增大，核酸、蛋白質(zhì)等大分子大量泄漏，致使細(xì)菌細(xì)胞凋亡率增加。沒食子酸是一種具有潛在應(yīng)用前景的水產(chǎn)品保鮮劑，后續(xù)研究可考慮探究沒食子酸在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用。


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