2.3流式細胞術檢測人參外泌體對RAW264.7細胞極化的影響
人參外泌體作用于RAW264.7細胞后，使用流式細胞術檢測M1型巨噬細胞分子標志CD80的表達，實驗結果表明（圖3），與空白對照組相比，經過不同濃度的人參外泌體處理后，M1型巨噬細胞分子標志CD80顯著升高（P<0.05），且具有濃度依賴性，濃度為20μg/mL時，M1型型巨噬細胞分子標志CD80上調最為顯著（P<0.01），濃度為10μg/mL時次之。這表明人參外泌體可以有效的刺激巨噬細胞向M1方向極化。
圖3流式細胞術檢測人參外泌體對RAW264.7細胞極化的影響
注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.001。
2.4人參外泌體刺激巨噬細胞M1極化對A549細胞活力的影響
A549細胞與條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后，使用CCK-8檢測A549細胞的活性，實驗結果表明（圖4），與空白對照組相比，LPS組A549細胞活力受到抑制（P<0.001）；與空白對照組相比，隨著人參外泌體給藥濃度的增加，A549細胞活力呈梯度下降，人參外泌體濃度為20μg·mL?1時，A549細胞的細胞活力最低（P<0.001），其次是人參外泌體濃度為10μg·mL?1（P<0.001），人參外泌體濃度為5μg·mL?1（P<0.001）時抑制能力最弱；這表明人參外泌體可以顯著抑制A549細胞的生長，減弱腫瘤細胞A549的增殖能力。
圖4人參外泌體刺激巨噬細胞M1極化對A549細胞活力的影響
注：與空白對照組相比，***P<0.001。
2.5人參外泌體刺激巨噬細胞極化對A549細胞周期的影響
腫瘤細胞的快速增殖與細胞周期的進程密切相關，調控腫瘤細胞的細胞周期，促進其快速凋亡是目前腫瘤治療的重要研究方向[26]，細胞周期一般分為G0、G1、S、G2和M期，主要受c-myc、cyclin A、cyclin D1等基因調控[27]，主要細胞分裂過程中發(fā)生的細胞周期停滯引起的損傷和錯誤很難修復[28]。通過流式細胞儀檢測A549細胞的細胞周期，實驗結果表明（圖5），與空白對照組相比，LPS組A549細胞的G1期細胞數目增多（P<0.01），S期細胞數目減少；與空白對照組相比，人參外泌體中劑量組與人參外泌體高劑量A549細胞處于G1期細胞數目增多（P<0.05），S期的細胞數目顯著減少（P<0.05）。這意味著人參外泌體在G1期阻斷了A549細胞的細胞周期，從而阻止了DNA的正常復制，抑制了腫瘤的生長。
圖5人參外泌體刺激巨噬細胞極化對A549細胞周期的影響
注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。
2.6人參外泌體刺激巨噬細胞極化對A549細胞凋亡的影響
細胞周期進程被阻滯后，將會進一步導致細胞凋亡，凋亡是通過激活內在自殺機制而誘發(fā)的細胞程序性死亡過程。采用流式細胞儀檢測人參外泌體刺激巨噬細胞M1極化對A549細胞凋亡的影響（圖6），與空白對照組相比，LPS組凋亡的細胞比例顯著升高（P<0.01）；與空白對照組相比，人參外泌體給藥組細胞凋亡的比例顯著升高，人參外泌體的濃度為10μg·mL?1凋亡的細胞比例最高（P<0.01），其次是人參外泌體濃度為20μg·mL?1，人參外泌體濃度為5μg·mL?1凋亡的細胞比例最低（P<0.01）。這表明人參外泌體通過刺激巨噬細胞M1極化從而有效地誘導了A549細胞的凋亡。
圖6人參外泌體刺激巨噬細胞極化對A549細胞凋亡的影響
注：與空白對照組相比，**P<0.01。
2.7人參外泌體通過激活TLR4/MyD88信號通路促進A549細胞凋亡
TLR4信號可以通過MyD88和TRIF途徑傳遞。MyD88通路通過募集IL-1受體相關激酶（IRAK-κ）誘導NF-κB的早期激活。IRAK蛋白與TNF受體相關因子6（TRAF6）相互作用并激活。TRAF6招募并激活TAK1。TAK1激活了核因子κB激酶（IKK），然后NF-κB結合抑制蛋白IκB被IKK磷酸化，隨后泛素化和降解，導致NF-κB的二聚體p65-p50失去抑制作用，然后發(fā)揮其轉錄因子的作用，進入細胞核驅動炎性胞質分裂的轉錄基因。NF-κB作為一種轉錄因子，與機體的炎癥反應密切相關，NF-κB的活化將導致iNOS、COX-2蛋白表達增加。為了進一步明確人參外泌體刺激巨噬細胞極化抑制A549細胞增殖的內在機制，采用Western blot檢測A549細胞中TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2蛋白的表達，結果顯示（圖7），與空白對照組相比，LPS組和不同劑量的人參外泌體給藥組TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2蛋白表達均增加。其中NF-κB的表達具有明顯的濃度依賴性，與空白對照組相比，人參外泌體高劑量組NF-κB的表達最高（P<0.01），中劑量組次之（P<0.01），低劑量組NF-κB的表達最低（P<0.01）。
圖7人參外泌體刺激巨噬細胞M1極化對A549細胞TLR4/MyD88通路相關蛋白表達的影響
注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。
3.結論
本次實驗模擬腫瘤微環(huán)境，收集LPS和人參外泌體處理的RAW264.7細胞衍生的上清液，制成CM并與A549共培養(yǎng)，首次證實了人參外泌體促進巨噬細胞向M1極化，激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路促進炎癥因子的表達水平，顯著抑制A549細胞增殖，調節(jié)A549細胞周期，從而誘導A549細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，本研究對人參外泌體在非小細胞肺癌（NSCLC）相關疾病的治療領域奠定了實驗基礎，并為進一步探索人參外泌體在TLR4/MyD88/NF-κB信號通路方面的相關研究提供了理論支持。但人參外泌體促進巨噬細胞M1極化后M1型巨噬細胞所占比例尚不明確，我們將繼續(xù)深入研究M1型巨噬細胞與A549細胞之間相互作用的具體機制。
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