研究簡介：抗生素耐藥性是一項(xiàng)全球性挑戰(zhàn)，對全世界人類健康構(gòu)成日益嚴(yán)重的威脅。污水處理廠中ARGs的來源和歸宿在活性污泥工藝中得到了深入研究。由于活性污泥中細(xì)菌密度高和生物多樣性豐富，污水處理廠更容易發(fā)生ARG轉(zhuǎn)移。然而，關(guān)于活性污泥細(xì)菌中ARG轉(zhuǎn)移的研究很少。重金屬是污水處理廠常見的污染物，已有研究證明金屬離子的影響關(guān)于ARG的共軛轉(zhuǎn)移。有研究表明Ag(I)、Zn(II)和Cr(VI)，在環(huán)境相關(guān)和亞抑制濃度下，促進(jìn)了大腸桿菌菌株之間的ARG轉(zhuǎn)移。然而這些研究主要集中在特定細(xì)菌之間的ARG轉(zhuǎn)移，而忽略了作為廢水中ARGs的港灣和放大器的活性污泥細(xì)菌。在亞抑制水平上，很少研究這些重金屬如何影響ARG的轉(zhuǎn)移。漂浮狀態(tài)下ARG轉(zhuǎn)移的研究主要通過傳統(tǒng)燒瓶進(jìn)行（Jutkina et al.,2016)，工作量大，時(shí)間長，操作復(fù)雜。很難同時(shí)在多種條件下進(jìn)行交配分析。幸運(yùn)的是，全自動(dòng)生長曲線分析儀（Bioscreen C）可以進(jìn)行高通量實(shí)驗(yàn)來解決現(xiàn)有的問題，它可以自動(dòng)并行運(yùn)行200個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的兩個(gè)孔板，為同時(shí)在不同條件下進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)提供了一種新方法。由于活性污泥中微生物群落的多樣性可能與細(xì)菌傳播ARG的可能性以及活性污泥中存在的眾多機(jī)會(huì)性病原體有關(guān)，因此有必要了解ARG傳播到污水處理廠中高度敏感的潛在物種的潛力。在本研究中，計(jì)算機(jī)培養(yǎng)箱(Bioscreen C)和流式細(xì)胞儀結(jié)合評(píng)估六種環(huán)境相關(guān)金屬（Cu(II)、Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)、As(V)和Hg(II))影響ARG轉(zhuǎn)移。研究分析了轉(zhuǎn)接合子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率、系統(tǒng)發(fā)育組成和微生物代謝功能，以評(píng)估不同金屬對ARG轉(zhuǎn)移的影響。
Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀的應(yīng)用
使用全自動(dòng)生長曲線分析儀（Bioscreen C，F(xiàn)inland）來估計(jì)供體和受體細(xì)菌的單個(gè)金屬的半抑制濃度（IC 50）。對不含重金屬（對照）或補(bǔ)充有不同濃度的CuSO 4、ZnSO 4、CdCl 2、Pb（NO 3）2、NaH 2 AsO 4或HgCl 2的合成廢水介質(zhì)進(jìn)行抑制測定。將5μL混合菌液和295μL培養(yǎng)基注入孔板（每孔體積為300μL），每個(gè)樣品重復(fù)三次。之后，將平板孵育48 h在25°C下中速，自動(dòng)讀數(shù)器每60分鐘記錄一次OD 600值，持續(xù)48小時(shí)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：研究表明重金屬可以刺激抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)移(ARGs)之間的細(xì)菌。然而以往的研究大多集中在純菌株，重金屬的影響關(guān)于ARG在細(xì)菌群落，特別是活性污泥中的轉(zhuǎn)移，還沒有明確的探索。本研究開發(fā)了一種結(jié)合全自動(dòng)生長曲線分析儀(Bioscreen C)和流式細(xì)胞儀的高通量方法。評(píng)價(jià)不同濃度重金屬對污泥菌群中ARG轉(zhuǎn)移的影響。以大腸桿菌(Escherichia coliMG1655)為供體，對廣譜IncP-1質(zhì)粒pKJK5進(jìn)行鑒定0.5 mmol/L Pb、0.1 mmol/L As和0.005 mmol/LHg能明顯促進(jìn)污泥細(xì)菌中ARG的轉(zhuǎn)移。
圖1、合成廢水下供體和受體的IC 50值
圖2、不同濃度Cu(II)、Zn(II)、Cd(II)、對大腸桿菌MG1655和活性污泥菌的劑量-響應(yīng)生長抑制曲線。
圖3、不同濃度Pb(II)、As(V)和Hg(II)對大腸桿菌MG1655和活性污泥菌的劑量-響應(yīng)生長抑制曲線。
圖4、在不同的金屬脅迫條件下，通過共聚焦激光罐形顯微鏡(CLSM)觀察48h后ARG轉(zhuǎn)移到活性污泥菌的芯片上。紅點(diǎn)是供體細(xì)胞，綠點(diǎn)是轉(zhuǎn)接合子。
圖5、對Ck(不含重金屬對照)和不同重金屬脅迫條件下轉(zhuǎn)接合子池前25個(gè)屬的共軛電位進(jìn)行了分析。
總結(jié)：本論文研究評(píng)估了六種不同濃度的重金屬對污泥細(xì)菌群落中ARG轉(zhuǎn)移的影響。研究人員開發(fā)了結(jié)合Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀和流式細(xì)胞術(shù)的高通量方法來進(jìn)行交配測定和轉(zhuǎn)接合子計(jì)數(shù)。結(jié)果表明重金屬，包括0.5 mmol/L Pb(II)、0.1 mmol/L As(V)和0.005 mmol/L Hg(II)，可以促進(jìn)污泥細(xì)菌群落中的ARG轉(zhuǎn)移。與對照相比，轉(zhuǎn)移頻率增加了1.25到2倍。此外，將微流控芯片應(yīng)用于培養(yǎng)附著細(xì)菌，證明上述重金屬促進(jìn)了ARG轉(zhuǎn)移。假單胞菌、氣單胞菌、腸桿菌和埃希氏菌-志賀氏菌是轉(zhuǎn)接合子的優(yōu)勢屬，由于其豐度高且有可能接受ARG編碼的質(zhì)粒，因此應(yīng)引起關(guān)注。轉(zhuǎn)接合子的功能預(yù)測表明與重金屬抗性相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最為豐富。該研究進(jìn)一步了解重金屬對污泥細(xì)菌群落中ARG轉(zhuǎn)移的影響，這對于評(píng)估和控制污水處理廠中的ARG具有重要意義。
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