黃曲霉菌(Aspergillusflavus)，是腐生性的病原真菌。主要存在于玉米、棉花、花生以及許多干果和香料中。分離出來的大多黃曲霉菌都能產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物黃曲霉毒B1(AFB1)，它具有致癌性、致畸性、免疫抑制性，被認定為自然界中危害性最大的生物毒素之一。黃曲霉毒素污染是極其棘手的食品安全問題，黃曲霉毒素除對人畜的健康造成極大的危害外，也會對社會經(jīng)濟造成巨大的損失。因此如何有效地防治黃曲霉的污染具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。
黃曲霉及其毒素污染防控一直是國際國內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究領域的熱點和難點，黃曲霉毒素的防治方法主要有物理、化學、生物三種方法，但物理法費時費力、去毒力不高，化學農(nóng)藥對環(huán)境有較大危害，而利用生物防治法來抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的技術處理條件比較溫和，對產(chǎn)品質量影響較小，有利于環(huán)境保護及人體健康。因此，綠色防控技術已經(jīng)成為當前發(fā)展趨勢。黃曲霉及其毒素污染的生物防控是重要發(fā)展方向。
目前，黃曲霉毒素生物防治技術主要包括利用不產(chǎn)毒霉菌、拮抗微生物及其活性物質、植物源活性物質來抑制黃曲霉的產(chǎn)毒及生長。研究乳酸菌對乳制品中黃曲霉毒素污染的生防作用，發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以抑制黃曲霉生長及黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生，乳酸菌屬的許多菌株，包括丙酸桿菌屬Propionibacterium、乳球菌Lactococcus、雙歧桿菌Bifi-dobacterium和乳酸桿菌屬Lactobacillus等，均具有抑制黃曲霉生長及產(chǎn)毒的作用，但乳酸菌屬厭氧菌，在實際應用過程中難以保證厭氧的環(huán)境，從而限制了乳酸菌作為拮抗菌的實際應用?？浊嗟劝l(fā)現(xiàn)一株海洋巨大芽孢桿菌可以抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，其在培養(yǎng)基中抑制率約為87%，并且此株巨大芽孢桿菌只可在受機械損傷的花生上抑制黃曲霉毒素的生物合成。
隨著人們對綠色環(huán)保理念的興起，生物防治黃曲霉菌侵染及其毒素產(chǎn)生成為一種主流研究方向。非脫羧勒克菌(Leclerciaadecarboxylata)wt16，是非脫羧勒克菌屬惟一的1個菌種，是腸桿菌科的一種具有動力的革蘭陰性桿菌，通常來源于環(huán)境和動物，于1962年被發(fā)現(xiàn)，生化特性與大腸埃希菌相似，其對黃曲霉的生防作用此前并未見報道，本研究首次將該非脫羧勒克菌wt16菌株進行對黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒的研究，并找出其有效作用成分，因此本文為日后研究分離鑒定非脫羧勒克菌wt16分泌的有效抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物提供了理論基礎。
1材料與方法
1.1材料與儀器
非脫羧勒克菌wt16分離自湖北黃陂，保存于中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所;7個高產(chǎn)毒黃曲霉菌株73、271、393-2、54、pc157-2、pg11、pc400為本實驗室前期分別從廣西北海、福建郡武、湖北黃陂、福建泉州、南昌進賢、江西樟樹、湖北紅安分離獲得;大腸桿菌(E.coli)為本實驗室分離保存;PDA培養(yǎng)基美國BD公司;LB固體培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司;乙醇、吐溫80、丙三醇、磷酸鹽緩沖液(PBS)國藥集團化學試劑有限公司;甲醇安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司。
恒溫培養(yǎng)振蕩器天津市歐諾儀器儀表有限公司;LEICA DMLS型光學顯微鏡德國LEICA公司;SU8010型高分辨場發(fā)射掃描電鏡日本HITACHI公司;AUTESTER-E30型高壓滅菌鍋西班牙J.PSELECTA公司;WFO-400型干燥箱上海愛朗儀器有限公司;CPA224S型電子天平德國Sartorius公司。
1.2實驗方法
1.2.1非脫羧勒克菌wt16種子液的制備LB固體平板上活化非脫羧勒克菌wt16菌株，37℃培養(yǎng)箱放置24 h，挑取單菌落于液體LB試管中，置于搖床中發(fā)酵，200 r/min，37℃，培養(yǎng)12 h。在實驗過程中通過菌懸液濃度與吸光度值的回歸方程進行計算，將后續(xù)實驗所需菌懸液濃度配制成107CFU/mL。
1.2.2黃曲霉菌孢子懸浮液的制備7種黃曲霉菌株(73、271、393-2、54、pc157-2、pg11、pc400)分別在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水(含0.1%的吐溫80)將孢子從培養(yǎng)基上洗下，用血球板計數(shù)法計數(shù)。
1.2.3非脫羧勒克菌wt16對不同地區(qū)黃曲霉菌生長的影響將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)和7種不同地區(qū)的黃曲霉菌孢子懸液(5×105個/mL)同時接種于15 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，以無菌培養(yǎng)液為空白、以大腸桿菌培養(yǎng)液(1×107CFU/mL)為對照替代非脫羧勒克菌wt16菌液，28℃培養(yǎng)5 d，分別測定菌絲干重。
1.2.4菌絲干重的測定以Whatman No.4濾紙過濾培養(yǎng)液，得到的菌絲于80℃烘干至恒重后，稱重。根據(jù)抑制率(%)=(對照組菌絲干重-處理組延菌絲干重)/對照組菌絲干重×100%，計算對黃曲霉菌絲生長的抑制率。
1.2.5非脫羧勒克菌wt16對不同地區(qū)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)和7種不同地區(qū)黃曲霉孢子懸液(5×105個/mL)同時接種于15 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，對照組分別以無菌培養(yǎng)液、大腸桿菌培養(yǎng)液(1×107CFU/mL)替代非脫羧勒克菌wt16菌液，28℃培養(yǎng)5 d，取1 mL培養(yǎng)液測定其黃曲霉毒素B1(AFB1)含量。抑制率(%)=(對照組毒素含量-處理組毒素含量)/對照組毒素含量×100。
1.2.6黃曲霉毒素的定量檢測將不同地區(qū)黃曲霉菌株在沙氏液體培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)7 d，產(chǎn)生孢子后用無菌吐溫水沖洗孢子制成孢子菌懸液，以終濃度為5×105個/mL在沙氏液體培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)5 d，雙層Whatman No.4濾紙過濾后用免疫親和柱-HPLC法檢測培養(yǎng)液中的黃曲霉毒素B1的含量。
取1 mL待測液過免疫親和柱，將黃曲霉毒素截留，用1 mL的甲醇洗脫，進行高效液相分析，HPLC檢測條件為:色譜柱:Boston Boschrom ODS，4.6×150 Vmm，5 Vμm;流動相:甲醇45%，水55%;光衍生流速:1 mL/min進樣量:10μL;熒光檢測器激發(fā)波長:360 nm;發(fā)射波長:440 nm。
1.2.7非脫羧勒克菌wt16在花生粉上對黃曲霉73菌生長與產(chǎn)毒的影響將采集于湖北花生地，大小、成熟度均勻一致，無腐爛的花生顆粒研磨成花生粉，稱取1 g該花生粉于培養(yǎng)皿中，同時加入1 mL產(chǎn)毒力較居中的黃曲霉菌73孢子液(5×105個/mL)及1 mL非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)，以沙氏培養(yǎng)基代替非脫羧勒克菌wt16菌液為對照，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后加入15 mL 70%甲醇水，渦旋后放入搖床30 min。取3 mL上清加入8 mL超純水渦旋離心，取8 mL上清用免疫親和柱-HPLC法測定黃曲霉毒素B1的含量。抑制率(%)=(對照組毒素含量-處理組毒素含量)/對照組毒素含量×100。
1.2.8非脫羧勒克菌wt16在花生顆粒上對黃曲霉菌73生長與產(chǎn)毒的影響取采集于湖北花生地，大小、成熟度均勻一致，無腐爛無機械損傷的花生顆?；ㄉ?0粒，將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)包覆在花生表面，同時加入1 mL黃曲霉菌73孢子液(5×105個/mL)，以沙氏培養(yǎng)基代替wt16菌液為對照;將已接種后的花生粒在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后，觀察其生長情況，然后將花生粒研磨成花生粉，加入15 mL 70%甲醇水，渦旋后放入搖床30 min。取3 mL上清加入8 mL超純水渦旋離心，取8 mL上清用免疫親和柱-HPLC法測定黃曲霉毒素B1的含量。抑制率(%)=(對照組毒素含量-處理組毒素含量)/對照組毒素含量×100。
1.2.9非脫羧勒克菌wt16菌株對黃曲霉菌73株形態(tài)影響掃描電鏡分析將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)和黃曲霉菌73孢子懸液(5×105個/mL)同時接種于15 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，對照組分別以無菌培養(yǎng)液為對照，在28℃，200 r/min培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)好的黃曲霉菌絲經(jīng)3000 r/min離心8 min富集沉淀，取沉淀浸入磷酸鹽緩沖液PBS(0.1 mol/L、pH7.2、不含NaCl)中，漂洗細胞或組織數(shù)次，3000 r/min離心8 min去上清，加4℃預冷的戊二醛，在4℃固定4 h，吸出固定劑，用PBS浸洗3次。用系列梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)分別脫水1次，再用100%乙醇徹底脫水2次，接下來加醋酸異戊酯2次后使其自然干燥。用真空噴鍍法噴鍍均勻，完成后在掃描電鏡下分別放大100倍、2000倍、5000倍、20000倍進行觀察。
1.2.10非脫羧勒克菌wt16菌株不同發(fā)酵組分對黃曲霉73的影響為了探究非脫羧勒克菌wt16不同組分對黃曲霉菌73的影響，將wt16菌株進行了3組處理，處理如下:處理Ⅰ:將非脫羧勒克菌wt16菌液以12000 r/min離心20 min后取其上清液用0.22μm無菌濾膜過濾制備無菌發(fā)酵上清液，在上清液中加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d;處理Ⅱ:將非脫羧勒克菌wt16菌株發(fā)酵上清液以121℃高溫處理30 min后加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d;處理Ⅲ:非脫羧勒克菌wt16菌株發(fā)酵液121℃高溫處理30 min滅活后的死菌體將用無菌水洗滌3遍后用沙氏液體培養(yǎng)基溶解，加入黃曲霉73孢子液后培養(yǎng)5 d;并進行兩組對照:對照Ⅰ:以無菌培養(yǎng)基為對照，在沙氏液體培養(yǎng)基中加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d;對照Ⅱ以大腸桿菌作為對照菌株將其(107CFU/mL)加入沙氏液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后，加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d。將以上處理測其菌絲干重及其黃曲霉73毒素含量。
1.2.11發(fā)酵時間對非脫羧勒克菌wt16菌株有效成分的影響將非脫羧勒克菌wt16菌株(107CFU/mL)加入到沙氏液體培養(yǎng)基中，在200 r/min，28℃搖床中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9 d，以12000 r/min離心20 min，121℃高溫30 min制備無菌上清液，在其中加入黃曲霉73孢子液(5×105個/mL)，在200 r/min，28℃搖床中培養(yǎng)5 d后測其黃曲霉毒素含量。
1.2.12發(fā)酵溫度對非脫羧勒克菌wt16菌株有效成分的影響分別在10、15、20、25、30、35、40、45℃條件下，200 r/min搖床培養(yǎng)非脫羧勒克菌wt16菌液5 d，以12000 r/min離心20 min，121℃高溫處理30 min制備上清液，加入黃曲霉73孢子液(5×105個/mL)，在200 r/min，28℃搖床中培養(yǎng)5 d后測其黃曲霉73毒素含量。
1.3數(shù)據(jù)處理
所有實驗內(nèi)設3個重復，數(shù)據(jù)采用Excel分析處理。
實驗證明：非脫羧勒克菌wt16可抑制黃曲霉生長性及產(chǎn)毒（一）
實驗證明：非脫羧勒克菌wt16可抑制黃曲霉生長性及產(chǎn)毒（二）
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