2結果與討論
2.1非脫羧勒克菌wt16對不同地區(qū)黃曲霉菌生長的影響
由圖1可知，在沙氏液體培養(yǎng)基中，與對照組相比，非脫羧勒克菌wt16菌株能使不同地區(qū)黃曲霉菌絲干重明顯降低，其抑制率最低為77%，最高為92%，而與對照菌株大腸桿菌共培養(yǎng)的不同地區(qū)黃曲霉菌菌絲干重并未明顯降低，表明wt16能有效抑制不同地區(qū)黃曲霉菌的生長。
圖1 wt16對不同地區(qū)黃曲霉菌生長的影響
2.2非脫羧勒克菌wt16對不同地區(qū)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響
由圖2可知，在沙氏液體培養(yǎng)基中，與對照組相比，非脫羧勒克菌wt16菌株能使不同地區(qū)黃曲霉菌合成的毒素明顯降低，其抑毒率最低為90%，最高為96%，而與大腸桿菌共培養(yǎng)的不同地區(qū)黃曲霉菌產(chǎn)毒并未明顯降低，表明wt16能有效抑制不同地區(qū)黃曲霉菌的產(chǎn)毒。
圖2 wt16對不同地區(qū)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響
2.3非脫羧勒克菌wt16在花生粉上對不同地區(qū)黃曲霉73菌生長與產(chǎn)毒的影響
為了探究非脫羧勒克菌wt16菌株是否也能應用于營養(yǎng)條件復雜的花生中，本實驗在花生粉上同時接種黃曲霉73菌及非脫羧勒克菌wt16。由圖3可知，在花生粉上，經(jīng)由黃曲霉73菌侵染的花生粉上長滿了黃綠色黃黃曲霉孢子，而非脫羧勒克菌wt16與黃曲霉73菌共培養(yǎng)的花生粉上黃曲霉孢子明顯減少，說明wt16菌株能明顯抑制黃曲霉生長;由圖4可知，與對照相比，經(jīng)黃曲霉菌侵染的花生粉經(jīng)非脫羧勒克菌wt16處理后，處理組中黃曲霉73毒素B1含量明顯低于對照組，其抑制率達83.19%。
圖3 wt16在花生粉上對黃曲霉生長的影響注:(A)為經(jīng)由黃曲霉菌73侵染的花生粉;(B)為黃曲霉菌73與wt16共培養(yǎng)的花生粉。
圖4 wt16在花生粉上對黃曲霉菌73產(chǎn)毒的影響
2.4非脫羧勒克菌wt16在花生顆粒上對黃曲霉73菌生長與產(chǎn)毒的影響
為了探究研究非脫羧勒克菌wt16菌株在無機械損傷的花生粒上是否也有抑制黃曲霉73生長及產(chǎn)毒的作用，本實驗在花生粒上同時接種黃曲霉及非脫羧勒克菌wt16。由圖5可知，在花生上，經(jīng)由黃曲霉73菌侵染的花生粒表面長出許多黃綠色的孢子，而黃曲霉73與非脫羧勒克菌wt16共培養(yǎng)的花生粒上黃曲霉孢子明顯減少，說明wt16菌株能顯著抑制黃曲霉生長;由圖6可知，與對照相比，經(jīng)黃曲霉73菌侵染的花生粒經(jīng)wt16處理后，處理組中黃曲霉73毒素B1含量明顯比對照組低，其抑制率達88.64%。
圖5 wt16在花生粒上對黃曲霉菌73生長的影響注:圖A為黃曲霉菌T3與wt16共培養(yǎng)的花生粒;圖B為經(jīng)由黃曲霉菌73侵染的花生粒。
圖6 wt16在花生顆粒上對黃曲霉73菌產(chǎn)毒的影響
2.5非脫羧勒克菌wt16菌株對黃曲霉73菌株形態(tài)影響掃描電鏡分析
黃曲霉菌73在沙氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后可觀察到，黃曲霉73可形成規(guī)則的菌絲球體，單個菌絲呈細長型，表面有絨毛(圖7A)，而與非脫羧勒克菌wt16作用后，黃曲霉73菌絲會聚集成不規(guī)則形狀，單個菌絲會由細長型斷裂成小截形態(tài)，菌絲表面會變得較光滑(圖7B)。
圖7 wt16菌株對黃曲霉菌株形態(tài)影響掃描電鏡圖
注:(A)為黃曲霉73菌絲體在掃描電鏡下放大100×、2000×、5000×、20000×的形態(tài)圖;(B)為與wt16菌株作用過后的黃曲霉73菌絲體在掃描電鏡下放大100×、2000×、5000×、20000×的形態(tài)圖。
2.6非脫羧勒克菌wt16菌株不同發(fā)酵組分對黃曲霉73菌的影響
由表1可知，與對照Ⅰ相比，非脫羧勒克菌wt16上清液能抑制黃曲霉73菌的生長及產(chǎn)毒，進行高溫處理后的上清液只能抑制黃曲霉73菌的產(chǎn)毒而不能抑制黃曲霉73菌的生長，非脫羧勒克菌wt16的死菌體對黃曲霉73菌沒有作用，而大腸桿菌的上清液(對照Ⅱ)不能抑制黃曲霉73菌產(chǎn)毒，說明非脫羧勒克菌wt16上清中有某種代謝產(chǎn)物對黃曲霉菌株73菌的產(chǎn)毒和生長有抑制作用，并且其代謝產(chǎn)物中有某些可以抑制黃曲霉73菌生長的產(chǎn)物在經(jīng)高溫處理后會失去抑制作用，而高溫對能抑制產(chǎn)毒的代謝物質無影響。
表1 wt16不同組分對黃曲霉73菌的影響(n=3)
2.7發(fā)酵時間對非脫羧勒克菌wt16菌株有效成分的影響
由圖8可知，對照組中黃曲霉毒素含量為(237.27±13.63)ng/mL，黃曲霉73菌在培養(yǎng)1 d的非脫羧勒克菌wt16上清液中生長5 d后產(chǎn)毒量為(30.83±3.59)ng/mL，其抑制率為87%，1～3 d對黃曲霉菌73的產(chǎn)毒抑制率差異性不顯著(p>0.05)，6 d培養(yǎng)出來的wt16上清液對黃曲霉菌73的產(chǎn)毒抑制率最高，其毒素含量為(11.5±3.08)ng/mL，抑制率達93.85%，但4～9 d的抑制率差異性不顯著(p>0.05)，因此wt16培養(yǎng)時間超過4 d最佳。
2.8發(fā)酵溫度對非脫羧勒克菌wt16有效成分的影響
由圖9可知，在10℃時wt16菌株會變性，菌液變粘稠，無法離心制備wt16菌株的發(fā)酵上清液，在45℃時wt16菌株不生長。實驗結果發(fā)現(xiàn)，對照組毒素含量為(294.71±6.65)ng/mL，在40℃培養(yǎng)時wt16發(fā)酵上清液對黃曲霉73菌的產(chǎn)毒抑制率最高，其毒素含量為(11.61±4.04)ng/mL，對黃曲霉73菌的產(chǎn)毒抑制率達96.1%，其余溫度毒素含量差異性不顯著(p>0.05)，因此wt16培養(yǎng)溫度在15～40℃均可。
圖9發(fā)酵溫度對wt16有效成分的影響
3結論
本實驗在前期篩選獲得一株非脫羧勒克菌wt16的基礎上，首次研究表征了非脫羧勒克菌wt16對黃曲霉具有抑生長性及抑毒性，研究發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)基中，非脫羧勒克菌wt16能明顯抑制黃曲霉菌的生長及產(chǎn)毒，并且對不同地區(qū)分離出來的黃曲霉菌均有抑制作用，其對黃曲霉菌絲生長抑制率達77%、92%，對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率達90%～96%，對有無損傷的花生均能抑制黃曲霉菌的生長及產(chǎn)毒。用掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)非脫羧勒克菌wt16能改變黃曲霉菌菌絲形態(tài)。非脫羧勒克菌wt16在15～40℃條件下培養(yǎng)4 d后，其發(fā)酵上清液對黃曲霉菌產(chǎn)毒抑制率最高。
雖然黃曲霉毒素的生物防治取得了一定的研究進展，但目前的研究仍存在許多不足之處，對其有效抑菌成分的研究還缺乏深入的探討，如果能分離鑒定出確切的抑菌成分，將會加速生防黃曲霉毒素研究的進程，初步認為該非脫羧勒克菌wt16菌株能通過產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物來抑制黃曲霉的生長及產(chǎn)毒，這個結果與其他拮抗劑如枯草芽孢桿菌及短小芽孢桿菌的研究結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)非脫羧勒克菌wt16對黃曲霉的生長及產(chǎn)毒有很好的抑制作用，具有潛在的應用價值，但由于本實驗未做安全性評價，為了避免活菌影響，本實驗室將進一步研究非脫羧勒克菌wt16上清液內的有效活性成分，再利用對環(huán)境無害的活性成分進行黃曲霉菌生物防治的應用。
實驗證明：非脫羧勒克菌wt16可抑制黃曲霉生長性及產(chǎn)毒（一）
實驗證明：非脫羧勒克菌wt16可抑制黃曲霉生長性及產(chǎn)毒（二）
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