變形桿菌屬（Proteus）是腸桿菌科的一個(gè)種屬，革蘭氏陰性菌，廣泛存在于爬蟲、鳥類、哺乳動(dòng)物和人類腸道內(nèi)。變形桿菌可引發(fā)創(chuàng)傷感染、膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等。目前，多用抗生素防控變形桿菌引起的疾病，但細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，新種類抗生素出現(xiàn)短缺現(xiàn)象，在治療嚴(yán)重的細(xì)菌感染方面產(chǎn)生了大量的未得到滿足的醫(yī)療需求。噬菌體是細(xì)菌的天然“殺手”，不會(huì)被細(xì)菌的耐藥性制約，能特異性識(shí)別并殺滅病原菌，不會(huì)破壞其他菌群。噬菌體分布廣泛且具有自我繁殖能力強(qiáng)、專一性高等優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于變形桿菌噬菌體的研究，目前還處于起步階段。關(guān)于變形桿菌噬菌體基因組的研究較少，對(duì)變形桿菌噬菌體進(jìn)行分離鑒定及分析非常必要。
西南民族大學(xué)青藏高原研究院的蘇雅航，侯忠余，唐俊妮*等通過(guò)對(duì)牦牛屠宰場(chǎng)采集污水中的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA鑒定，發(fā)現(xiàn)在牦牛屠宰場(chǎng)存在變形桿菌污染，對(duì)食品安全造成潛在的威脅。為了更好地防治該細(xì)菌污染，減少抗生素使用，本研究以變形桿菌為宿主菌，從牦牛屠宰場(chǎng)采集的污水中分離得到1株裂解型噬菌體，通過(guò)研究該噬菌體的生物學(xué)特性，以及進(jìn)行噬菌體基因組分析，旨在豐富變形桿菌的噬菌體庫(kù)，為進(jìn)一步開發(fā)新型噬菌體抗菌劑提供基礎(chǔ)。
分離菌株的16S rRNA鑒定
分離菌株用16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增后，將67株菌PCR產(chǎn)物送檢測(cè)序得到菌株的核酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)菌株29與糞腸球菌同源性較高，10株與變形桿菌同源性高達(dá)98%～99%，1株與葡萄球菌同源性99%。選取同源性較高的變形桿菌菌株序列，用MEGA X的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。結(jié)果顯示，2、7、8、12、22、23、29、65、66菌株和普通變形桿菌（P.vulgaris）在同一分支上，親緣關(guān)系較近，從分子水平確定10株菌株為普通變形桿菌。
宿主菌的耐藥表型分析
本研究選取1株與普通變形桿菌同源性較高的菌株66為代表，探究其藥物敏感性。如表1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株66對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、諾氟沙星、苯唑西林等6種抗生素敏感，對(duì)阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素等6種抗生素中度敏感，對(duì)頭孢西丁、青霉素、氨芐西林、紅霉素、萬(wàn)古霉素等9種抗生素耐受。
分離噬菌體的噬菌斑形態(tài)與透射電鏡結(jié)構(gòu)
以變形桿菌為宿主菌，經(jīng)3次富集后分離的到1株烈性噬菌體。選取的噬菌體經(jīng)3次純化后，經(jīng)培養(yǎng)可在雙層瓊脂平板上形成清晰、透亮、大小均一的噬菌斑（圖2A、B），將其命名為Proteus phage PV66。將純化噬菌體液進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染后透射電鏡觀察，結(jié)果顯示，噬菌體由1個(gè)棒狀的頭部和可伸縮尾部組成（圖2C、D）。頭部長(zhǎng)（140±1）nm、寬（54±1）nm，尾部長(zhǎng)為（36±1）nm，從形態(tài)上初步判斷噬菌體屬于短尾噬菌體，與C3形態(tài)的噬菌體較為接近。
噬菌體裂解譜
如表2所示，通過(guò)點(diǎn)斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定裂解譜，結(jié)果顯示該噬菌體可裂解10株變形桿菌中的4株，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的沙門噬菌、糞腸球菌、大腸桿菌和阪奇克羅諾桿菌未表現(xiàn)出裂解活性。表明噬菌體可裂解部分變形桿菌，其裂解效力將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。
噬菌體的最佳MOI測(cè)定結(jié)果
從圖3可以看出，在6組不同的MOI中，當(dāng)MOI為0.1時(shí)，噬菌體效價(jià)最高為3.18×1011 PFU/mL，MOI為0.001、1和10時(shí)效價(jià)次之，MOI為0.01和100效價(jià)最低，表明噬菌體PV66最佳MOI為0.1。
噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果
如圖4所示，噬菌體的潛伏期為10 min，這段時(shí)間噬菌體量基本沒(méi)有增加；爆發(fā)期為100 min，在感染后0～80 min內(nèi)，噬菌體持續(xù)增長(zhǎng)，在80 min后趨于平穩(wěn)，因此噬菌體感染期的時(shí)間約為80 min。裂解末期噬菌體效價(jià)為12.2×1010 PFU/mL，感染初期宿主菌濃度為3.8×108 CFU/mL，得到噬菌體PV66感染宿主菌的裂解量約為321 PFU/cell。
理化因素對(duì)噬菌體的影響
如圖5A所示，通過(guò)對(duì)噬菌體PV66溫度耐受的測(cè)定，在60 min處理時(shí)間下，隨著溫度升高，噬菌體活性受到顯著影響，在溫度高于55℃，噬菌體效價(jià)開始急劇下降，在溫度高于75℃，噬菌體PV66失去活性。由圖5B可知，噬菌體在pH 3～12范圍內(nèi)，其效價(jià)均值在108以上，具有穩(wěn)定和良好的裂解活性。當(dāng)pH值為2和13時(shí)，完全失去感染宿主的能力。結(jié)果分析表明噬菌體作用的pH值范圍較廣，可具有良好的運(yùn)用價(jià)值，但對(duì)高溫敏感，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)噬菌體活性受到明顯影響。
由圖6可知，噬菌體在60 min內(nèi)被紫外照射后效價(jià)依然可達(dá)109 PFU/mL，但對(duì)80%丙酮耐受性較低，對(duì)50%DMSO、75%乙醇與SM液耐受性較高。
不同MOI的噬菌體對(duì)宿主菌的裂解效果
如圖7所示，在10 min內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照曲線保持上升狀態(tài)，MOI為0.1的曲線在0～2 h內(nèi)呈上升狀態(tài)后穩(wěn)定不變，隨后呈下降趨勢(shì)，MOI為10、100、1 000的曲線與陰性對(duì)照曲線在1 h基本保持一致，由此可知，不同MOI的噬菌體可以很好地抑制宿主菌的生長(zhǎng)，且MOI越高，抑菌效果越好。
噬菌體全基因組測(cè)序分析
基因組特征
如表3所示，基于全基因組測(cè)序結(jié)果，噬菌體PV66全序列長(zhǎng)度為90 492 bp，基因組GC含量為38.28%。預(yù)測(cè)了143個(gè)編碼序列（coding sequence，CDS），129個(gè)CDS為假想蛋白，其中9個(gè)CDS具有潛在功能，分別為DNA聚合酶、DNA連接酶、核酸相關(guān)酶及結(jié)構(gòu)蛋白，4個(gè)tRNA。未發(fā)現(xiàn)毒力基因及細(xì)菌抗性基因，未預(yù)測(cè)出噬菌體的裂解酶蛋白與Holi系統(tǒng)，原因可能是數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于變形桿菌噬菌體功能基因的信息量不足。
噬菌體PV66基因編碼與同源蛋白比對(duì)分析
將噬菌體序列注釋后的結(jié)果在NCBI的NT數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，如表4所示，發(fā)現(xiàn)噬菌體與Cronobacter phage vB_CsaP_009和Proteus phage Privateer具有相似的蛋白，且均具有93%以上的核酸序列相似性。BLAST結(jié)果表明，與Cronobacter phage vB_CsaP_009相似的蛋白有111種，與Proteus phage Privateer相似蛋白有17種。vB_CsaP_009與Privateer均為C3形態(tài)噬菌體[39]，由比對(duì)結(jié)果可知，PV66與vB_CsaP_009具有較高相似性。
基因組比較分析
把噬菌體PV66的全基因組序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示PV66與Proteus phage Privateer、Cronobacter phage vB_CsaP_009的同源性較高分別為89.34%、95.20%，與其他噬菌體基因同源性較低，將兩條同源性較高的序列與PV66噬菌體系列進(jìn)行基因比較，發(fā)現(xiàn)PV66與Proteus phage Privateer和Cronobacter phagevB_CsaP_009基因間存在缺失與插入的差異，顯示PV66噬菌體可能為一個(gè)全新的噬菌體。
噬菌體的系統(tǒng)發(fā)育分析
選擇噬菌體的主要衣殼蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析。如圖8所示，發(fā)現(xiàn)PV66與奇異變形桿菌噬菌體podophage Privateer和克羅諾桿菌噬菌體vB_CsaP_009均有83%的相似性，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)PV66和vB_CsaP_009處于同一分支上，結(jié)合噬菌體的電鏡形態(tài)特征與噬菌體宿主菌可判斷PV66為C3形態(tài)、non-Kuravirus屬的噬菌體。
討論與結(jié)論
多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，普通變形桿菌和奇異變形桿菌均對(duì)多種抗生素表現(xiàn)為耐藥。本研究從牦牛屠宰過(guò)程中分離純化的菌株純培養(yǎng)后進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定，通過(guò)在GenBank比對(duì)發(fā)現(xiàn)有10株菌與普通變形桿菌同源性為98%～99%，通過(guò)耐藥表型的分析發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)頭孢西丁、青霉素、氨芐西林、紅霉素、萬(wàn)古霉素等9種抗生素耐受，如果在牦牛屠宰過(guò)程中變形桿菌未及時(shí)清除，可能會(huì)對(duì)人類和其他動(dòng)物造成潛在的危險(xiǎn)。隨著抗生素監(jiān)管措施越來(lái)越嚴(yán)格，促使人們不斷尋找新型安全的抗菌劑。噬菌體是一種特異性強(qiáng)且裂解性高的對(duì)細(xì)菌具有殺滅作用的病毒，對(duì)噬菌體的分離鑒定及生理特性的研究，對(duì)治療耐藥細(xì)菌感染具有重要的意義。
本研究從四川某屠宰場(chǎng)采集的污水中分離到1株烈性噬菌體，透射電鏡發(fā)現(xiàn)噬菌體為罕見(jiàn)的C3形態(tài)噬菌體。最佳MOI為0.1，一步生長(zhǎng)曲線表明噬菌體的潛伏期短，裂解量高，對(duì)溫度的耐受值最高為65℃，pH值耐受范圍2～13，對(duì)紫外線照射及有機(jī)試劑耐受性良好，且對(duì)細(xì)菌的裂解效果較好。這些性質(zhì)與之前報(bào)道的變形桿菌噬菌體特性相差不大，表明噬菌體PV66具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
基因組學(xué)是從分子水平了解噬菌體特性的有效方法之一。本研究將提取到的序列選用prokka進(jìn)行注釋，注釋出143個(gè)CDS，預(yù)測(cè)出14個(gè)CDS具有假定的功能，另外的129個(gè)CDS功能未知。注釋的蛋白為DNA連接酶、DNA聚合酶及核酸有關(guān)的酶和結(jié)構(gòu)蛋白衣殼蛋白，含有4個(gè)tRNA。RNA酶可確保tRNA在宿主體內(nèi)保持穩(wěn)定和足夠的數(shù)量，以促進(jìn)噬菌體蛋白質(zhì)的快速產(chǎn)生，能夠幫助噬菌體更好地適應(yīng)不同的宿主菌或環(huán)境。大部分CDS功能未知，主要是因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于變形桿菌噬菌體功能基因的信息量仍然不足，目前關(guān)于變形桿菌噬菌體功能基因的研究結(jié)果仍然很有限。因此，在噬菌體功能基因組學(xué)的研究中，未知基因功能的鑒定仍然是比較迫切的工作。
本研究以牦牛屠宰場(chǎng)分離到的變形桿菌為宿主菌，從污水中分離到1株烈性噬菌體PV66，是鮮少被報(bào)道感染變形桿菌宿主的短尾噬菌體，并表現(xiàn)出典型的尾狀病毒感染特征，包括爆炸裂解行為，此種噬菌體宿主范圍相對(duì)較窄，可感染與變形桿菌最接近且具有遺傳親緣關(guān)系的克羅諾桿菌。分析其生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)其具有潛伏期短、爆發(fā)量大、pH值作用范圍廣、溫度耐受性高等優(yōu)點(diǎn)?；蚪M分析預(yù)測(cè)了形態(tài)發(fā)生、裂解、DNA復(fù)制和重組以及生物合成等蛋白質(zhì)功能，未發(fā)現(xiàn)抗生素相關(guān)基因和毒力基因，因此，噬菌體PV66將具有較好的應(yīng)用于變形桿菌生物防治的潛力。
本文《1株新的變形桿菌噬菌體的分離、鑒定與生物學(xué)特性分析》來(lái)源于《食品科學(xué)》2023年44卷第18期214-222頁(yè)，作者：蘇雅航,侯忠余,寇肖迪,等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221003-018。
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