3討論與結論
昆蟲病原線蟲進入昆蟲體內后，將其攜帶的共生細菌釋放于寄主昆蟲的血淋巴中，共生細菌迅速繁殖產生殺蟲毒素，昆蟲病原線蟲自身分泌的毒素結合共生細菌產生的活性物質分解寄主昆蟲組織，使寄主昆蟲在短時間內患敗血癥死亡(王大業(yè)，2020)。目前已經有對昆蟲病原線蟲共生細菌的殺蟲蛋白和共生菌代謝產物開發(fā)的研究，結果表明，共生細菌具有殺蟲活性主要是其代謝產物中的血腔活性物質起作用(彭劉亮，2017)，包括抑菌活性物質(黃武仁等，2005;Fangetal.，2011;Binda-Rossettietal.，2016)、殺蟲毒素(Bowenetal.，1998;Sheetsetal.，2011;Yangetal.，2012)、抗癌活性物質(Paiketal.，2001)等，在目前的相關研究中，昆蟲病原線蟲共生細菌常被用作生物制劑應用于害蟲生物防治及生態(tài)環(huán)保領域。
本研究結果表明，共生細菌作為昆蟲病原線蟲在寄主昆蟲體內生長繁殖的重要介體，其生長發(fā)育可以受胰島素的調控，共生細菌可以直接吸收利用胰島素。本研究結果將在利用昆蟲病原線蟲共生細菌及其代謝產物提高對害蟲的致病力方面提供新思路(吳文丹等，2014;王杰等，2021)，而對于共生細菌的具體殺蟲機制以及能否利用胰島素提高共生細菌代謝產物活性，尤其是血腔活性物質的活性，進而改善昆蟲病原線蟲共生細菌的殺蟲效果等問題還尚不明確，這也將成為未來新的研究方向。
本研究結果表明，一定濃度胰島素處理會促進共生細菌伯氏致病桿菌0657L菌落的生長(圖1，2)，不同濃度的胰島素對伯氏致病桿菌0657L生長速率的提高程度不同，低濃度胰島素(1∶5 000)較高濃度胰島素處理(1∶500)生長快(圖3)。
而有趣的是，高濃度胰島素(1∶500)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L運動和吞咽能力均強于低濃度胰島素(1∶5 000)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L(圖5，6)。在實驗數(shù)據(jù)上表現(xiàn)為促進共生細菌生長速率加快的最佳濃度為1∶5 000，而促進線蟲行為學能力增強的最佳濃度是1∶500。這表明，胰島素對卡森斯氏線蟲0657L生長發(fā)育及其體內分離出的共生細菌伯氏致病桿菌0657L的生長都有影響，但可能因為細菌和線蟲的生長繁殖方式不同，對胰島素的吸收和利用的方式也不同，因此共生細菌在形態(tài)學上表現(xiàn)出低濃度胰島素處理下直徑更大，而被取食后，仍然為高濃度更有利于線蟲抵抗運動和吞咽能力衰退，這就與營養(yǎng)成分利用有關，具體機理還有待進一步考究。
胰島素作為一種內分泌激素，與細胞生長、壽命、營養(yǎng)、生殖有關，還可促進蛋白質合成及脂肪儲存，防止脂肪分解等。胰島素在機體中的功能表現(xiàn)在多個方面，涉及受體結合，信號傳導系統(tǒng)和缺陷的糾正等，進食和禁食期間能量的儲存和釋放，基本由胰島素調控，是生物體生存的重要方面(Mayeretal.，2007;顧世紅和陳建國，2009;Thevisetal.，2010)。胰島素、胰島素樣生長因子(insulin growth factor，IGF)和胰島素樣肽(insulin-like peptide，ILP)通常與維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關，當機體內胰島素分泌不足時，來自食物的糖分就只流動在血液中，無法進入細胞為機體所用，此時胰島素的補充能夠幫助食物中的糖分順利進入機體內各組織細胞以提供能量(顧世紅和陳建國，2009)，這種功能在昆蟲(果蠅)和秀麗隱桿線蟲中是保守的(Thevisetal.，2010;Graham and Pick，2017)，此外，胰島素在代謝、生長、繁殖、成蟲健康和衰老方面也發(fā)揮著重要作用(Hafen，2004)。胰島素信號通路是高度保守的衰老調控通路，包括Ins R/IRS-1通路和RAS/MAPK通路(Beale，2013)。其中IRS-1可通過PI3K/Akt通路起到促進胰島素影響葡萄糖代謝與脂質代謝的作用，該通路中胰島素受體同源蛋白daf-16受基因daf-2負調控(張思雨等，2022)。本研究發(fā)現(xiàn)，胰島素處理在明顯促進卡森斯氏線蟲0657L共生細菌的生長的同時，有延長昆蟲病原線蟲壽命、抵御運動和吞咽能力衰退作用。這可以說明昆蟲病原線蟲作為共生細菌的攜帶者，能夠通過胰島素處理的特異性共生細菌間接地影響昆蟲病原線蟲體內新陳代謝信號的傳導(共生細菌吸收胰島素后長勢更佳，為昆蟲病原線蟲提供穩(wěn)定的生活環(huán)境和豐富的營養(yǎng)物質，其中蛋白質、脂類及少量糖類參與其體內細胞膜的組成，細胞膜完整保證了細胞的正常能量和物質交流)，從而起到抗衰老的作用，初步揭示了胰島素在昆蟲病原線蟲及其共生細菌生長發(fā)育中的作用。
研究表明，壽命的延長通常是與飲食限制(dietary restriction，DR)和熱量限制(caloric restriction，CR)有關的，且飲食限制誘導的壽命延長的其中一個關鍵通路是IIS(胰島素/胰島素樣生長因子1)信號傳導(N?ssel and Vanden，2016)。在本研究中，吞咽試驗為直接在線蟲生長培養(yǎng)基上統(tǒng)計中食道球抽動次數(shù)，即線蟲正常取食，說明并未造成飲食限制(即饑餓)，而已有報道線蟲(秀麗隱桿線蟲)可在多種不同飲食限制方案下主要通過激活LET-363/mTOR和IIS兩個營養(yǎng)物傳感途徑延長壽命(Greer and Brunet，2009)，結合上述證據(jù)，可推斷胰島素能夠延長昆蟲病原線蟲的壽命，且排除胰島素對卡森斯氏線蟲0657L壽命的延長作用是由飲食限制引起的可能性，這與人類醫(yī)學模式生物秀麗隱桿線蟲C.elegans的壽命研究結果并不完全吻合。鑒于本研究中線蟲攝食正常但最終得到壽命延長的結論，初步猜想是某些酶通過IIS通路中的靶標基因(如UTX-1)調控壽命(Greer and Brunet，2009)，共生細菌吸收胰島素后為卡森斯氏線蟲0657L提供豐富的營養(yǎng)成分，線蟲充分利用營養(yǎng)物質至體內蛋白(酶)合成達到平衡時，相應靶標基因所在的信號通路關閉，基因表達量降低，衰老相關細胞功能維持穩(wěn)態(tài)，壽命得以延長。這也恰好說明，壽命不僅在遺傳水平上被調控，而且與新陳代謝調節(jié)和營養(yǎng)物質也密切相關。
研究使用胰島素處理的共生細菌培養(yǎng)卡森斯氏線蟲0657L，發(fā)現(xiàn)線蟲生長早期，頭部擺動次數(shù)和吞咽次數(shù)均較慢，生命中期，其頭部擺動頻率和咽泵吞咽頻率均提高，直到生命后期又有一定程度的下降，說明線蟲的衰老隨著生命過程而發(fā)生，主要體現(xiàn)在運動和吞咽能力上。運動和吞咽與肌肉功能息息相關(Dall and F?rgeman，2019;劉嘉榆，2022)，3個不同生長階段中的胰島素處理組運動和吞咽能力均較對照組強，表明胰島素可以提高線蟲的肌肉功能，起到有效抵抗衰老的作用。
綜上所述，胰島素的補充可以促進昆蟲病原線蟲共生細菌的生長，能夠延長昆蟲病原線蟲的平均壽命并提高運動和吞咽能力。本研究僅證實了胰島素在線蟲生物學特征方面的作用，為昆蟲病原線蟲的制劑化提供了新的思路，也為昆蟲病原線蟲在生物防治領域的進一步高效開發(fā)利用提供了理論基礎。為明確其作為調控機體代謝的重要物質在表觀遺傳學上是否也具有類似的作用，具體的作用機制如何，還需通過分子生物學技術手段的進一步探究。