棒桿菌屬細(xì)菌由于具有生物安全(美國(guó)FDA認(rèn)證)、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求低、底物譜廣等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的理想工業(yè)底盤菌株，廣泛應(yīng)用于氨基酸和有機(jī)酸等化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)，尤其是在賴氨酸、谷氨酸等氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中占據(jù)主導(dǎo)地位。多年來(lái)現(xiàn)有技術(shù)對(duì)棒桿菌屬菌株進(jìn)行了大量的研究和遺傳改造，包括氨基酸合成途徑、底物利用途徑、增強(qiáng)氨基酸外排等的改造，已經(jīng)獲得了較高水平的產(chǎn)氨基酸的棒桿菌屬工程菌株。目前，多種氨基酸的工業(yè)發(fā)酵水平超過(guò)100g/L，賴氨酸的工業(yè)發(fā)酵水平超過(guò)200g/L(Xu,J.Z.,et al.,Microb Cell Fact,2020,19,39；戶紅通等,中國(guó)釀造,2018,37(10),51-56)。
然而，在發(fā)酵過(guò)程中，高濃度賴氨酸、谷氨酸等發(fā)酵產(chǎn)物的積累以及底物的不斷流加均對(duì)棒桿菌細(xì)胞造成極高的滲透壓，高滲透壓也幾乎是所有高水平工業(yè)菌株在發(fā)酵后期都會(huì)面臨的環(huán)境脅迫(Varela C et al.Applied Microbiology And Biotechnology2003,60(5):547-555)，直接影響細(xì)胞的膨脹度、完整性、水合程度和分子擁擠程度等，從而干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，成為影響終產(chǎn)物合成效率的關(guān)鍵因素，限制了工業(yè)菌株發(fā)酵水平的進(jìn)一步提升。增強(qiáng)棒桿菌屬菌株對(duì)高滲透壓的耐受能力，是提高發(fā)酵產(chǎn)物終濃度，提升生物發(fā)酵經(jīng)濟(jì)性的有效手段。但是，現(xiàn)有技術(shù)中，由于缺乏高通量的功能基因鑒定方法，目前，已經(jīng)挖掘到的棒桿菌來(lái)源的滲透壓耐受性功能基因極少，從而限制了棒桿菌發(fā)酵性能的進(jìn)一步提升。
為克服現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，技術(shù)人員首先構(gòu)建了一種基于谷氨酸棒桿菌全基因組單基因過(guò)表達(dá)庫(kù)的功能基因的高通量篩選方法，用于高通量快速地篩選能提高菌株對(duì)高滲透壓力的耐受性的功能基因，從而提升菌株的氨基酸產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。
賴氨酸高滲透壓條件過(guò)表達(dá)提高生長(zhǎng)基因的初篩
構(gòu)建的C.glutamicum ATCC13032全基因組單基因過(guò)表達(dá)庫(kù)，共計(jì)3000多個(gè)菌株，分別進(jìn)行賴氨酸高滲透壓條件的生長(zhǎng)初篩。種子和高滲透壓培養(yǎng)均采用Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀進(jìn)行培養(yǎng)和測(cè)定OD600。種子培養(yǎng)如下：將C.glutamicum ATCC13032全基因組單基因過(guò)表達(dá)庫(kù)的過(guò)表達(dá)菌株與對(duì)照菌株C.glutamicum ATCC13032(pEC-0)分別接種到含有25μg/mL卡那霉素的TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板，裝液400μL，30℃培養(yǎng)8h。
取10μL培養(yǎng)好的種子液，分別轉(zhuǎn)接到賴氨酸高滲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板，裝液400μL，培養(yǎng)基含有0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，30℃，800rpm培養(yǎng)96-106h，設(shè)置每隔1h測(cè)定OD600，全面篩選過(guò)表達(dá)可以提高以上高滲透壓條件細(xì)胞生長(zhǎng)的基因。高滲培養(yǎng)基成分為(g/L)：(NH4)2SO4，20g/L；尿素，5g/L；KH2PO4，1g/L；K2HPO4·3H2O，1.3g/L；MOPS，42g/L；CaCl2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；ZnSO4·7H2O，0.001g/L；CuSO4，0.0002g/L；NiCl·6H2O，0.00002g/L；gSO4·7H2O，.25g/L；原兒茶酸，0.03g/L；VB1，0.0001g/L；生物素，0.0002g/L；酵母粉，2g/L；葡萄糖，40g/L；賴氨酸，175g/L；H2SO4調(diào)節(jié)pH 7.1-7.2。所有過(guò)表達(dá)菌株的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)OD600分別與對(duì)照菌株計(jì)算比值，歸一化處理所有批次數(shù)據(jù)，再計(jì)算30h至終點(diǎn)生長(zhǎng)過(guò)程連續(xù)15個(gè)最大值的平均值，然后將15個(gè)值均提高或降低20％以上的基因判定為生長(zhǎng)提高或降低基因。
所有基因均顯示了30h至終點(diǎn)生長(zhǎng)過(guò)程連續(xù)15個(gè)最大值的平均值，其中最上面的深色點(diǎn)是15個(gè)值均提高20％以上的基因，下面的深色點(diǎn)代表15個(gè)值均降低20％以上的基因。生長(zhǎng)提高的基因一共29個(gè)，包括以下基因cgl0011、cgl0063、cgl0470、cgl0487、cgl0489、cgl0490、cgl0893、cgl0917、cgl0923、cgl1010、cgl1118、cgl1367、cgl1472、cgl1532、cgl1541、cgl1605、cgl1653、cgl1941、cgl1994、cgl2392、cgl2496、cgl2610、cgl2735、cgl2806、cgl2937、cgl2911、cgl2998、cgl3003、cgl3098。
賴氨酸高滲透壓生長(zhǎng)提高基因的復(fù)篩
將初篩所得到的29個(gè)生長(zhǎng)提高的基因，進(jìn)行賴氨酸高滲透壓和非高滲透壓的復(fù)篩。將初篩所得到的29個(gè)基因的過(guò)表達(dá)菌株和C.glutamicum ATCC13032(pEC-0)對(duì)照菌株，分別接種至含有25μg/mL卡那霉素的TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板，裝液400μL，30℃培養(yǎng)8h。按照初始OD600
為0.1分別轉(zhuǎn)接至非高滲和高滲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板裝液400μL，添加0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，30℃，800rpm培養(yǎng)96h至106h，每2h檢測(cè)一次OD600，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。依然使用Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀進(jìn)行培養(yǎng)和測(cè)定OD600。
高滲培養(yǎng)基成分為(g/L)：(NH4)2SO4，20g/L；尿素，5g/L；KH2PO4，1g/L；K2HPO4·3H2O，1.3g/L；MOPS，42g/L；CaCl2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；ZnSO4·7H2O，0.001g/L；CuSO4，0.0002g/L；NiCl·6H2O，0.00002g/L；MgSO4·7H2O，0.25g/L；原兒茶酸，0.03g/L；VB1，0.0001g/L；生物素，0.0002g/L；酵母粉，2g/L；葡萄糖，40g/L；賴氨酸，175g/L；H2SO4調(diào)節(jié)pH 7.1-7.2之間。非高滲培養(yǎng)基為在上述高滲培養(yǎng)基不添加賴氨酸。所有菌株的3個(gè)平行樣品每個(gè)時(shí)間點(diǎn)OD600分別計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，繪制每個(gè)菌株非高滲和高滲條件的生長(zhǎng)曲線。再分析30h至終點(diǎn)生長(zhǎng)過(guò)程每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品過(guò)表達(dá)菌株與對(duì)照菌株OD600
差異顯著性(T-test分析)，如果滿足高滲條件連續(xù)15個(gè)時(shí)間點(diǎn)及以上是P＆lt;0.05，且這些點(diǎn)的過(guò)表達(dá)菌株OD600
平均值均大于對(duì)照菌株，則該基因過(guò)表達(dá)可以提高賴氨酸高滲條件的菌株生長(zhǎng)。初篩獲得的29個(gè)基因，復(fù)篩后只有15個(gè)基因滿足以上要求，非高滲和高滲條件的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，可以看出cgl0063、cgl0470、cgl0917、cgl0923、cgl1010、cgl1118、cgl1472、cgl1994、cgl2392、cgl2496、cgl2610、cgl2806、cgl2911、cgl2998和cgl3003仍然是在高滲條件提高菌株生長(zhǎng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)cgl3003的過(guò)表達(dá)不僅可以提高菌株在高滲條件下的生長(zhǎng)，也可以提高菌株在非高滲條件的生長(zhǎng)；其它基因過(guò)表達(dá)只在高滲條件下提高菌株的生長(zhǎng)。在賴氨酸高滲條件，滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的基因在生長(zhǎng)提高階段時(shí)間點(diǎn)中最大提高幅度如下：cgl0063在68h最大可提高16％，cgl0470在72h最大可提高24％，cgl0917在66h最大可提高18％，cgl0923在72h最大可提高14％，cgl1010在72h最大可提高36％，cgl1118在42h最大可提高52％，cgl1472在72h最大可提高33％，cgl1994在96h最大可提高16％，cgl2392在72h最大可提高25％，cgl2496在90h最大可提高43％，cgl2610在90h最大可提高51％，cgl2806在90h最大可提高53％，cgl2911在103h最大可提高28％，cgl2998在104h最大可提高36％，cgl3003在60h最大可提高23％。
圖1.賴氨酸高滲透壓耐受基因的復(fù)篩結(jié)果；
圖2賴氨酸高滲透壓耐受基因在硫酸鈉高滲條件下的生長(zhǎng)
15個(gè)耐高滲基因?qū)α蛩徕c滲透壓耐受性的驗(yàn)證
將復(fù)篩所獲得的15個(gè)的基因過(guò)表達(dá)菌株和ATCC13032(pEC-0)對(duì)照菌株分別接種至含有25μg/mL卡那霉素的TSB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)8h，按照初始OD600
為0.1分別轉(zhuǎn)接硫酸鈉高滲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板裝液400μL每孔含有0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，使用Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀30℃800rpm培養(yǎng)96h至120h，每2h檢測(cè)OD600，實(shí)驗(yàn)三個(gè)平行，全面表征15個(gè)基因在谷氨酸棒桿菌高滲透壓力響應(yīng)與耐受中的功能。高滲培養(yǎng)基為在非高滲培養(yǎng)基中添加156g/L硫酸鈉。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，采用相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)15個(gè)基因在硫酸鈉高滲條件下也能提高生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，復(fù)篩所得到的15個(gè)基因過(guò)表達(dá)對(duì)于提高谷氨酸棒桿菌的高滲透壓耐受性具有有益效果。在硫酸鈉高滲條件下，生長(zhǎng)提高階段中，cgl0063在64h最大可提高25％，cgl0470在118h最大可提高40％，cgl0917在50h最大可提高37％，cgl0923在26h最大可提高44％，cgl1010在26h最大可提高46％，cgl1118在60h最大可提高11％，cgl1472在26h最大可提高36％，cgl1994在118h最大可提高20％，cgl2392在26h最大可提高63％，cgl2496在h最大可提高60％，cgl2610在26h最大可提高52％，cgl2806在26h最大可提高28％，cgl2911在26h最大可提高87％，cgl2998在26h最大可提高83％，cgl3003在26h最大可提高92％。
總結(jié)：通過(guò)對(duì)谷氨酸棒桿菌中的15種提高微生物滲透壓耐受性功能基因的過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可以提高菌株對(duì)于高滲透壓力的耐受性，促進(jìn)出發(fā)菌株生長(zhǎng)，從而提升菌株的氨基酸產(chǎn)量。
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