青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種廣泛分布的土傳病原細(xì)菌，能夠侵染50多個(gè)科，200多種植物，在全球范圍內(nèi)能夠?qū)е轮卮蟮慕?jīng)濟(jì)損失。由該菌引起的青枯病最早于1864年在煙草中報(bào)道，它的起源和早期傳播仍未確定。青枯雷爾氏菌能夠在潮濕的土壤或水體中存活數(shù)年，當(dāng)遭遇易感宿主，青枯雷爾氏菌就會(huì)進(jìn)入植物根部，在根部皮層定殖，然后入侵木質(zhì)部導(dǎo)管，最終通過導(dǎo)管系統(tǒng)迅速擴(kuò)展到植物地上部，在宿主體內(nèi)大量增殖引起導(dǎo)管堵塞與功能紊亂，出現(xiàn)萎焉癥狀。
hrcN基因作為植物病原菌T3SS結(jié)構(gòu)基因之一，表達(dá)產(chǎn)物為ATP酶（ATPase），通過催化ATP的水解為效應(yīng)蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP產(chǎn)生的能量重塑多種蛋白底物，因此在膜融合、蛋白質(zhì)修飾和降解等許多生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用。Pozidis等研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas syringas的HrcN是一種定位于外周膜上的ATP酶，能催化蛋白質(zhì)易位。與其他T3SS相關(guān)的ATP酶一樣，HrcN與F0/F1-ATPase亞基同源，包含介導(dǎo)ATP結(jié)合和水解的Walker框。由于T3SS分子伴侶不能被分泌或轉(zhuǎn)運(yùn)，必須在效應(yīng)蛋白分泌前從分子伴侶-效應(yīng)蛋白復(fù)合體中釋放出來，這種作用是由T3SS相關(guān)的ATP酶（InvC和HrcN）以ATP依賴的方式進(jìn)行的。這些ATP酶也作為T3SS效應(yīng)蛋白的去折疊酶發(fā)揮作用，使效應(yīng)蛋白保持未折疊或部分未折疊的構(gòu)象。最近Gan等研究發(fā)現(xiàn)T3SS效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)位依賴于分子伴侶HpaB的C端區(qū)域，其C-端區(qū)域的缺失極大的減少了從HpaB與T3SS效應(yīng)蛋白復(fù)合物中釋放出游離效應(yīng)蛋白的數(shù)量，其中，HrcN以ATP依賴的方式催化該反應(yīng)。蛋白互作研究顯示，HrcN與T3SS底物特異性開關(guān)蛋白HpaC以及分子伴侶HpaB相互作用，促進(jìn)多種效應(yīng)蛋白的分泌。研究還發(fā)現(xiàn)HrcN可與HrcU和HrcV內(nèi)膜蛋白互作。
前期在擴(kuò)增出青枯雷爾氏菌hrcN基因序列基礎(chǔ)上，比對(duì)發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因與假單胞菌Pseudomonas syringas1448A、黃單胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和細(xì)菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性較高，其中與細(xì)菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷爾氏菌T3SS基因hrcN為研究對(duì)象，利用融合PCR技術(shù)和電轉(zhuǎn)化獲得青枯雷爾氏菌CBM613菌株的hrcN基因突變株和回補(bǔ)菌株，通過測(cè)定致病力、生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。
1材料與方法
1.1供試材料
供試菌株與質(zhì)粒：野生型番茄青枯雷爾氏菌CBM613菌株由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院饋贈(zèng)，為強(qiáng)致病力菌株；TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自美國(guó)Thermo公司；pMD19-T載體購自日本TAKARA公司；pJQ200SK、pCVD442和pRK415質(zhì)粒載體本實(shí)驗(yàn)室保存。
供試植物：番茄為感病品種中蔬5號(hào)，28℃～30℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光周期16L﹕8D，相對(duì)濕度90%，種苗培養(yǎng)至5～6片葉時(shí)備用。
試劑及儀器：NA（Nutrient Agar）培養(yǎng)基（牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蒸餾水加至1000 mL，pH為6.8～7.0）、NB（Nutrient Broth）培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基不加瓊脂）、LB（Lysogeny Broth）培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.0）、TSB（Tryptic Soy Broth）培養(yǎng)基（胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.2）、Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（KH2PO413.6 g，(NH4)2SO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 mg，L-谷氨酸2.9 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.0）、半固體SMM（Supplemental minimal medium）培養(yǎng)基（葡萄糖0.1 g，蛋白胨0.1 g，EDTA-2Na 38 mg，瓊脂3.5 g，磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）10 mL，加入雙蒸水定容到1000 mL）、CPG（Casamino acids Peptone Glucose）培養(yǎng)基（酵母粉1 g，葡萄糖10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.0）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒購自德國(guó)QIAGEN公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)購自日本TAKARA公司；TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer購自立陶宛MBI公司；DMSO購自德國(guó)Biofroxx公司；其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。5910R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；C1000 PCR儀、核酸電泳儀、Versadoc 1000凝膠成像系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔轉(zhuǎn)化儀，美國(guó)BIO-RAD公司。
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