目的：探討小鼠β-防御素-2（beta defensin 2，BD2）對SiHa細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制。方法將pcDNA3．1（＋）/mBD 2、pcDNA3．1（＋）/rmBD 2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞SiHa/M、SiHa/R裂解，用細(xì)胞裂解上清進(jìn)行Western blot檢測mBD2蛋白表達(dá)；同時采用細(xì)胞活力分析對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活力進(jìn)行測定，采用AnnexinⅤ、PI流式細(xì)胞分析法和TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果SiHa/M、SiHa/R組在4～6 Ku區(qū)域出現(xiàn)目標(biāo)條帶；SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞在貼壁后2～3 d細(xì)胞活性明顯低于SiHa細(xì)胞（P＝0．018），但隨著時間推移，細(xì)胞活性開始下降，3組細(xì)胞的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．374）；SiHa/M、SiHa/R及SiHa組AnnexinⅤ＋/PI＋雙陽性細(xì)胞的百分率分別為2．4％、2．3％、2．3％；AnnexinⅤ＋/PI-細(xì)胞分別為0．9％、1．2％、1．5％，3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．743）；SiHa/M、SiHa/R組凋亡細(xì)胞發(fā)生率較高，分別達(dá)到40．7％、30．2％，而SiHa組細(xì)胞凋亡率只有7．3％，SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞凋亡率明顯高于SiHa組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．004）；SiHa/M組凋亡發(fā)生率高于SiHa/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．003）。結(jié)論mBD 2能夠抑制SiHa細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
抗菌肽是生物體抵御外界病原生物侵襲而產(chǎn)生的一種小分子多肽，具有廣譜的抗菌活性，并有抗真菌、病毒等生物學(xué)活性，而對正常細(xì)胞無傷害，是機(jī)體在長期進(jìn)化過程中保留下來的一種古老的宿主防御機(jī)制。哺乳動物體內(nèi)的抗菌肽主要是防御素(defensins)，作為生物體內(nèi)天然防御系統(tǒng)的重要組成部分，連接天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，對機(jī)體抵抗外界生物感染起著關(guān)鍵的作用。此外，許多科學(xué)研究表明防御素也具有抗腫瘤效應(yīng)，但其機(jī)制尚不完全清楚。現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的500多種抗菌肽中，有18種抗菌肽的抗腫瘤活性已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。宮頸癌是倍受世界關(guān)注的女性高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下，在全球位列女性惡性腫瘤的第二位，宮頸癌的防治成為保護(hù)婦女兒童健康的全球共同關(guān)注問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和腫瘤發(fā)生分子機(jī)制的深入研究，生物治療已成為腫瘤綜合治療的第4種模式，并具有廣泛的應(yīng)用前景。
本課題前期研究工作中，采用pcDNA3.1(+)/mBD2和具有明確穿膜功能的小鼠IgGΚ鏈的信號肽基因替代mBD2信號肽基因，形成IgGΚ鏈、成熟肽2個部分的重組防御素分子質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/rmBD2轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，制備了宮頸癌細(xì)胞瘤苗SiHa/M、SiHa/R。本研究對細(xì)胞的特性進(jìn)行了體外研究，為進(jìn)一步觀察其體內(nèi)抗宮頸癌效果奠定基礎(chǔ)，同時為將防御素應(yīng)用于腫瘤免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1細(xì)胞株及質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/mBD2質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)/rmBD2質(zhì)粒宮頸癌細(xì)胞株SiHa/M、SiHa/R本室保存，宮頸癌SiHa細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心免疫學(xué)教研室魏大鵬老師惠贈，用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、10%胎牛血清在37℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
1.1.2試劑
RPMI1640、胎牛血清(GIBCO公司)，PVDF膜(invitrogen公司)，5%脫脂奶粉(invitrogen公司)，羊抗鼠mBD2抗體(Santa cruz公司)，兔抗羊IgG抗體、DAB(Fermentas公司)，AnnexinⅤ、PI、Rnase酶(Bioscience公司)，TUNEL試劑盒(Roche公司)，細(xì)胞活力分析采用BECKMAN VICELLA AUTO 100/240進(jìn)行測定。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞裂解上清mBD2蛋白表達(dá)
收集并裂解各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE(Tricine sodiumdodecyl sulfatepolyacry lamidegele lectrophoresis，Tricine-SDS-PAGE)電泳，分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinyli denedifluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜后，分別用1∶100稀釋羊抗鼠mBD2抗體孵育2 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，再用1∶1 000稀釋兔抗羊IgG抗體孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，DAB顯色檢測結(jié)果。
1.2.2細(xì)胞活力測定
取對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，分別接種于12塊6孔板中，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔。在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、5%CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后于每天同一時間分別消化3組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸后加入測量杯中，于細(xì)胞活力分析儀上進(jìn)行細(xì)胞活力測定，并繪制細(xì)胞活力曲線。
1.2.3 PI、AnnexinⅤ雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡
將各組細(xì)胞用胰酶消化離心收集細(xì)胞，PBS洗滌并用臺盼藍(lán)染色測定活細(xì)胞百分比，用PBS將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106個/mL。分別用含Rnase的AnnexinⅤ染色液、PI避光染色各30 min，流式細(xì)胞儀檢測并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1.2.4 TUNEL法測定細(xì)胞凋亡
將對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105個/mL于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿60%左右，用冰預(yù)冷的95%乙醇于-20℃固定20 min，室溫中晾干；依次在100%、95%、70%的乙醇依次脫水2 min，并采用3%H2O2甲醇溶液室溫30 min，0.1%Triton X-100于4℃2 min，滴加正常羊血清，室溫孵育10 min，滴加TdT及FITC標(biāo)記的核苷酸混合反應(yīng)液50μL，37℃60 min后終止標(biāo)記反應(yīng)(1×TdT Stop Buffer)，并采用DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡觀察凋亡結(jié)果并計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)按照在顯微鏡高倍鏡下(×400)觀察5個視野，每個視野數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占百分比，即為凋亡指數(shù)(AI)。
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