2.4 entB基因缺失株在富鐵和限鐵培養(yǎng)基中生長能力的比較
利用富鐵培養(yǎng)基LB和限鐵培養(yǎng)基T-medium分別培養(yǎng)大腸桿菌親本株和突變株，鑒定entB基因缺失對細菌攝取鐵促進生長的影響，結(jié)果顯示，大腸桿菌AN102和ATCC25922親本株在LB培養(yǎng)基中正常生長，2h后開始進入對數(shù)生長期，平臺期D600nm值達到1.0左右;突變株Mu1、Mu2與親本株生長曲線趨勢一致(圖6A、6B)。在T-medium培養(yǎng)基中約4h進入對數(shù)生長期，平臺期D600nm值達到0.6左右;突變株Mu1和Mu2沒有明顯的對數(shù)生長期，平臺期D600nm值比親本株降低約0.3(圖6C、6D)。
A、B，大腸桿菌AN102和ATCC25922親本株、突變株在LB培養(yǎng)基中生長曲線;C、D，大腸桿菌AN102和ATCC25922親本株、突變株在T-medium培養(yǎng)基中生長曲線
圖6大腸桿菌entB基因缺失株在富鐵和限鐵培養(yǎng)基中生長曲線
2.5大腸桿菌腸菌素對空腸彎曲菌的影響促生長試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌AN102培養(yǎng)上清孔周圍出現(xiàn)明顯的生長圈，而大腸桿菌AN102的突變株Mu1、Mu2培養(yǎng)上清孔周圍未見生長圈(圖7)。
將大腸桿菌培養(yǎng)上清液與T-medium以1∶1比例混合后接種空腸彎曲菌，通過菌落計數(shù)判定菌株的生長情況。結(jié)果顯示，接種后0和12h，各組菌株生長無顯著差異(P大于0.05)，菌落計數(shù)分別約為6.5和7.0lgCFU/mL;接種后24和36h，大腸桿菌AN102親本株培養(yǎng)上清中的空腸彎曲菌菌落數(shù)極顯著高于其他組(P小于0.01)，分別為7.8和8.2lgCFU/mL，而其他組約為7.0和7.3lgCFU/mL(圖8)。
圖7大腸桿菌腸菌素對空腸彎曲菌生長作用效果檢測
①A~D，培養(yǎng)時間分別為0、12、24和36h。②*，差異顯著(P小于0.05);**，差異極顯著(P小于0.01);無*，差異不顯著(P大于0.05)
圖8不同培養(yǎng)時間空腸彎曲菌菌落計數(shù)結(jié)果
3討論
目前關(guān)于腸菌素的檢測有多種方法，Schwyn等利用鐵載體對三價鐵有高度親和力的特性，開發(fā)了一種使用CAS和HDTMA作為指示劑的鐵載體測定法，此法偏向于對鐵載體定性檢測，無法測定腸菌素準確濃度;Uranga等利用串聯(lián)液相色譜-質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)、高效液相色譜(HPLC)和核磁共振光譜(NMR)測定腸菌素的濃度，但操作繁瑣且需特殊儀器;Cui等基于腸菌素單抗建立了一種定量檢測腸菌素的ic-ELISA方法，操作簡便快速，測定大腸桿菌分泌腸菌素的濃度可達417.3μg/mL。本試驗利用ic-ELISA方法對雞腸道分離的大腸桿菌腸菌素進行檢測，培養(yǎng)上清中腸菌素濃度介于11~126μmol/L之間，表明不同來源的大腸桿菌分泌腸菌素能力存在差異。
細菌基因敲除技術(shù)主要包括λRed重組系統(tǒng)介導的同源重組、自殺載體介導的同源重組、Cas9切口酶介導的CRISPR、轉(zhuǎn)座子介導的基因插入失活和RNA干擾技術(shù)等，目前λRed重組技術(shù)在大腸桿菌等腸桿菌科細菌基因突變中應(yīng)用成功率較高。前期利用自殺載體介導的同源重組技術(shù)構(gòu)建突變株，但突變效率較低，改用λRed同源重組技術(shù)后短時間內(nèi)成功構(gòu)建2株大腸桿菌entB基因缺失突變株，證實該技術(shù)適用于大腸桿菌的基因突變操作。
腸菌素介導的鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)由腸菌素合成、分泌、利用等一系列基因組成，其中entB是腸菌素合成過程中的一個關(guān)鍵基因。沙門菌entB基因缺失突變后不但喪失合成腸菌素的能力，而且在巨噬細胞中的存活能力顯著降低;在炎癥性腸道內(nèi)，人源多形擬桿菌可利用大腸桿菌分泌的腸菌素，但entB基因缺失突變后，多形擬桿菌在腸道內(nèi)的恢復能力顯著降低。本試驗構(gòu)建的2株大腸桿菌entB基因缺失突變株均喪失了合成腸菌素的能力，在富鐵培養(yǎng)基中生長性能不受影響，但在缺鐵培養(yǎng)基中生長能力顯著降低，表明在限鐵培養(yǎng)條件下腸菌素能夠促進大腸桿菌的生長。由于宿主體內(nèi)是一個缺鐵的環(huán)境，推測腸菌素介導的鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)在細菌生長和定植宿主過程中發(fā)揮重要作用。
宿主腸道內(nèi)不同微生物之間存在合作和競爭的關(guān)系，腸菌素在微生物相互作用過程中不僅作為鐵載體，而且作為一種信號分子，調(diào)節(jié)不同菌群在腸道內(nèi)的定植。研究顯示，腸道內(nèi)共生大腸桿菌分泌腸菌素競爭鐵，可抑制病原沙門菌在腸道內(nèi)的定植，而喪失腸菌素分泌能力的大腸桿菌無法抑制沙門菌的定植;除腸桿菌科細菌外，人源多形擬桿菌自身也不能分泌腸菌素，但可利用腸桿菌科細菌分泌的腸菌素促進其生長和定植，是宿主腸道內(nèi)的一種常見的共生菌。由于空腸彎曲菌自身不能合成腸菌素，本研究結(jié)果顯示，空腸彎曲菌可利用大腸桿菌分泌的腸菌素促進其在缺鐵環(huán)境中生長，為空腸彎曲菌利用異源腸菌素提供了試驗依據(jù)，但在宿主體內(nèi)空腸彎曲菌如何利用大腸桿菌分泌的腸菌素來促進其定植和感染，尚需進一步深入探究。
4結(jié)論
本試驗中30株雞腸道大腸桿菌分離株均可分泌腸菌素，大腸桿菌entB基因缺失突變后不能分泌腸菌素，在限鐵環(huán)境中的生長能力顯著降低，且大腸桿菌腸菌素在限鐵環(huán)境中能促進空腸彎曲菌的生長，結(jié)果為深入研究腸菌素介導的腸道細菌之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。
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