植物青枯?。˙acterial wilt）是由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的毀滅性土傳病害，病原菌分布范圍廣，可侵染煙草、番茄和馬鈴薯等50余科的數(shù)百種作物。青枯病菌從植株根部或傷口侵染，侵入植物木質(zhì)部維管束并快速通過(guò)維管系統(tǒng)進(jìn)入植物地上部分，對(duì)茄科作物危害尤為嚴(yán)重。煙草是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物，近年來(lái)隨著連作年限的增加，煙草青枯病流行和蔓延的速度加快，發(fā)病嚴(yán)重田塊發(fā)病率達(dá)100%，已成為煙草生產(chǎn)上的主要病害之一。
煙草青枯病菌具有較高的遺傳變異性和環(huán)境適應(yīng)能力，菌系復(fù)雜，危害嚴(yán)重且難以防治，成為煙草生產(chǎn)的重要限制因素之一。目前，生產(chǎn)上對(duì)煙草青枯病的防治主要采取農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治相結(jié)合的綜合措施。由于不同的防治方法均存在局限性，且細(xì)菌性青枯病與其他真菌、卵菌病害?；旌习l(fā)生，因此對(duì)青枯病的防治尚無(wú)十分有效的措施?；瘜W(xué)藥劑以其高效、速效的特點(diǎn)在病害防治中發(fā)揮著重要作用，目前市場(chǎng)上用于煙草青枯病防治的藥劑主要有有機(jī)氯、有機(jī)銅、有機(jī)硫、無(wú)機(jī)銅、無(wú)機(jī)硫及其復(fù)配藥劑等。
馮永新等測(cè)定了7種殺菌劑對(duì)煙草青枯病菌的毒力，其EC50介于101.02~212.70 mg/L之間，按照毒力大小依次為三氯異氰尿酸、氯尿·硫酸銅、噻菌銅、溴菌·壬菌銅、甲霜·福美雙、噻唑鋅和中生菌素。黃小琴等研究表明，硫酸鏈霉素、氫氧化銅、春雷霉素和噻唑鋅等7種殺菌劑對(duì)煙草青枯病的EC50在170.07~318.57 mg/L之間，且硫酸鏈霉素的毒力最大。
畢濤等從13種藥劑中篩選出可有效抑制煙草青枯病菌生長(zhǎng)的6種藥劑，其中3%四霉素水劑的抑菌效果最好。林天然等檢測(cè)了5種常用殺菌劑對(duì)煙草青枯病盆栽的防治效果，表明50%青枯靈和72%農(nóng)用硫酸鏈霉素對(duì)青枯病的防效達(dá)88.6%和79.6%，而1.8%辛菌胺醋酸鹽、80%乙蒜素和3%克菌康的防效分別為75.6%、56.7%和52.3%。鄭旭川等研究提出，25%溴菌·壬菌銅微乳劑、20%噻菌銅懸浮劑對(duì)煙草青枯病的防效在50%左右。
盡管化學(xué)防治已成為防控青枯病的主要方法，但目前還沒(méi)有特效藥劑。因此，挖掘作用機(jī)制獨(dú)特、防治效果優(yōu)異的化學(xué)藥劑對(duì)煙草青枯病的防治尤為重要。氧化磷酸化解偶聯(lián)抑制劑是將呼吸鏈中電子傳遞和ATP生成解偶聯(lián)的一類藥劑，由于該類藥劑無(wú)特異性靶標(biāo)，因此其抑菌譜更為廣泛，也不易產(chǎn)生抗藥性。氟啶胺是氧化磷酸化解偶聯(lián)抑制劑中的代表性藥劑，屬于吡啶胺類，對(duì)煙草黑脛病菌和根腫菌等大部分真菌及螨類均有良好的抑菌活性和防效。有研究表明，植物病原真菌對(duì)氟啶胺的抗藥性發(fā)展緩慢，且氟啶胺與非氧化磷酸化解偶聯(lián)作用機(jī)制的殺菌劑無(wú)交互抗藥性，可以用來(lái)治理已有的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。
單一藥劑的長(zhǎng)期、多頻次不合理使用可造成病原菌的抗藥性，如2016年農(nóng)用鏈霉素因抗藥性問(wèn)題最終退出了農(nóng)藥市場(chǎng)。納米抗菌材料較大的比表面積能夠增加其與病原菌接觸，提高抑菌活性，同時(shí)在化學(xué)滲透壓和物理?yè)p傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用下，使病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，因此在植物病害防控方面具有廣闊應(yīng)用前景。蒲麗等研究表明，納米二氧化鈦在陽(yáng)光或汞燈下照射4 h后對(duì)煙草青枯菌的殺菌率達(dá)90%以上。
蔡璘研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化鎂對(duì)煙草青枯病菌的抑制活性顯著高于普通氧化鎂，納米氧化鎂處理后煙草青枯病田間發(fā)病率可減少38.83%。金屬元素抗菌劑銅納米粒子在極低劑量下（0.22μg/mL）也能夠抑制地毯草黃單胞桿菌的生長(zhǎng)，從而高效控制石榴葉片枯萎病的發(fā)生。銀納米粒子與氟康唑聯(lián)用對(duì)白色念珠菌具有高效抑菌作用。但目前氟啶胺尚未應(yīng)用于細(xì)菌病害的防治。為篩選出高效防治煙草青枯病的藥劑，測(cè)定了煙草青枯菌對(duì)殺菌劑氟啶胺、雙苯菌胺、噻霉酮、鏈霉素和春雷霉素的敏感性，并將氟啶胺分別與納米硫、納米銀和納米銅進(jìn)行二元復(fù)配，評(píng)價(jià)其協(xié)同增效作用，旨在為篩選防治煙草青枯病的新型高效藥劑和實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥減量增效奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1煙草青枯病菌的分離鑒定
采集江西省撫州市宜黃、黎川、樂(lè)安、廣昌、資溪、南豐和崇仁發(fā)病煙田的青枯病發(fā)病煙株，將發(fā)病煙稈橫切成5 cm的小段，并將溢出的白色菌膿劃線挑入盛有1 mL無(wú)菌水的離心管中制成菌懸液。靜置片刻后，用移菌環(huán)在牛肉膏蛋白胨（NA）選擇性培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)（NA培養(yǎng)基121℃滅菌20 min，在溫度50~60℃時(shí)加入終濃度為50μg/mL放線菌酮、10μg/mL氯霉素和10μg/mL多黏菌素）。煙草青枯病菌分子鑒定PCR體系包括12.5μL DNA mix[生工生物工程（上海）股份有限公司]，0.2 pmol/L特異性引物759/760（5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′，5′-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3′），25 ng DNA模板，最后加入ddH2O補(bǔ)充至25μL，陰性對(duì)照為ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。
1.2供試藥劑
98%氟啶胺購(gòu)自上海弼眾商貿(mào)有限公司，98%雙苯菌胺購(gòu)自沈陽(yáng)化工研究院。99%噻霉酮購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司。98%鏈霉素購(gòu)自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。90%春雷霉素購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司。以上藥劑用二甲基亞砜配制成1×105μg/mL的母液，置于4℃條件下保存。納米銅、納米銀和納米硫藥液濃度均為1×103μg/mL，均購(gòu)自威晶納米新材料公司。
1.3煙草青枯病菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將煙草青枯病菌接種至培養(yǎng)液中，于30℃、120 r/min避光條件下進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)65 h，獲得細(xì)菌懸浮液。加樣板每孔加入營(yíng)養(yǎng)肉湯250μL和預(yù)培養(yǎng)的煙草青枯病菌菌液50μL，每個(gè)菌株重復(fù)3次。將加樣板置入Bioscreen C生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀（芬蘭Oy Growth Curves Ab公司），溫度設(shè)置為28~30℃、每隔30 min測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光值（OD600），并繪制煙草青枯病菌的生長(zhǎng)曲線。
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