1、材料與方法
1.1樣品采集與富集培養(yǎng)
原位聚球藻于2020年8月在渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位采集。利用CTD采樣器(Sea-Bird 911Plus，Sea-Bird，美國(guó))采集2~5 m水深的海水100 mL，經(jīng)48μm篩絹預(yù)過(guò)濾后用3μm針管過(guò)濾器過(guò)濾至含放線菌酮(0.05 mg·mL–1)的50 mL SNAX培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)條件為:溫度25℃，光照強(qiáng)度50μmol·m–2·s–1，光照周期12D:12L。
1.2培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法
在無(wú)菌條件下，分別將100 mL的富集培養(yǎng)藻液B12和H19于7 386 r/min、4℃條件下離心20 min，接種于無(wú)氮組分海鹽(Aquavitro，美國(guó)?；?配制的1 L改良的SNAX培養(yǎng)基中(硝酸鹽濃度為實(shí)驗(yàn)組濃度，銨鹽濃度為1.0μmol·L–1，其余成分濃度不變)。參照實(shí)際海域營(yíng)養(yǎng)鹽狀況，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)硝酸鹽濃度組，分別為0.1、1.0、10.0、100.0μmol·L–1，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)從第6 d開(kāi)始采取半連續(xù)培養(yǎng)方式，每間隔24 h從培養(yǎng)瓶中取出250 mL培養(yǎng)基并補(bǔ)充250 mL新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)持續(xù)15 d，期間每24 h測(cè)定藻細(xì)胞密度，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束測(cè)定聚球藻的色素含量、光合作用參數(shù)以及體系中的碳氮含量。
1.3分析測(cè)定方法
1.3.1聚球藻富集樣品的鑒定
取富集樣品1.40 mL，加入多聚甲醛(終濃度為0.5%)固定后，采用流式細(xì)胞儀(BD FACS Jazz，美國(guó))根據(jù)前向散射光(FSC)、側(cè)向散射光(SSC)、葉綠素a(FL-1，488 nm)、藻紅蛋白(FL-2，585 nm)和藻藍(lán)蛋白(FL-3，640 nm)熒光信號(hào)鑒定聚球藻及其色素類型。另取500 mL富集樣品過(guò)濾至0.22μm聚碳酸酯濾膜(Millipore Co.，美國(guó))，采用高通量測(cè)序分析聚球藻的系統(tǒng)發(fā)育分類。具體方法為使用DNA快速提取試劑盒(Fast DNAspin kit，MP BIO，美國(guó))抽提DNA，以聚球藻特異性引物rpoC1-39F/rpoC1-462R擴(kuò)增RNA聚合酶γ亞單位編碼基因。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;35個(gè)循環(huán)(95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s);72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在Majorbio有限公司(上海，中國(guó))使用PE300 Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。序列經(jīng)fastp v0.20.0質(zhì)控，F(xiàn)LASH v1.2.7拼接后，使用UPARSE v7.1剔除嵌合體，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似序列比對(duì)并以原綠球藻的PCC9511為外群，采用最大似然法用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。原始數(shù)據(jù)保存至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào):SAMN26533762-SAMN26533769)。
1.3.2藻細(xì)胞密度測(cè)定
采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定聚球藻細(xì)胞密度，方法同1.3.1。參照文獻(xiàn)方法計(jì)算聚球藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率和最大比生長(zhǎng)速率。
1.3.3葉綠素a和藻膽蛋白含量測(cè)定
取藻液40 mL，用甲醇法提取葉綠素a(Chl a)后，用分光光度計(jì)(Lambda 25，PerkinElmer，美國(guó))根據(jù)665 nm和652 nm處的吸光值計(jì)算葉綠素a濃度。另取藻液40 mL，用超聲破碎法提取藻膽蛋白，以PBS緩沖液為空白，測(cè)定565 nm、620 nm和650 nm處的吸光值，按照公式(1-3)計(jì)算分別藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)和藻紅蛋白(PE)的濃度。
式中，A620、A650和A565分別表示620、650和565 nm處的吸光值，cPC、cAPC和cPE分別表示PC、APC和PE的濃度(mg·mL–1)。
1.3.4光合生理參數(shù)測(cè)定
取藻液3 mL，暗適應(yīng)15 min后使用Aqua Pen手持式藻類葉綠素?zé)晒鈨x(WALZ，德國(guó))測(cè)量量子產(chǎn)率(Qy)和最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)值。測(cè)量光、飽和脈沖光及光化光分別設(shè)置為0.018、1 800和600μmol·m–2·s–1。
1.3.5營(yíng)養(yǎng)鹽及碳、氮含量測(cè)定
取藻液10 mL，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾至10 mL離心管中，利用連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3，Seal Analytical，德國(guó))測(cè)定銨鹽(NH4+)，硝酸鹽(NO3–)，亞硝酸鹽(NO2–)和磷酸鹽(PO43–)的濃度。另取藻液10 mL，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾至酸洗棕色玻璃瓶中，利用全自動(dòng)總有機(jī)碳分析儀(TOC-VCPH，Shimadzu，日本)測(cè)定總有機(jī)碳(TOC)、總無(wú)機(jī)碳(TIC)和總氮(TN)的含量。
1.4數(shù)據(jù)分析
使用FlowJo 10.6.2軟件分析流式細(xì)胞儀獲得的數(shù)據(jù)，使用Origin 2018進(jìn)行繪圖，使用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)，設(shè)置顯著性水平為P<0.05。
相關(guān)新聞推薦
1、植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線及膽鹽水解酶產(chǎn)量（二）
2、室溫條件下pH、aw及鹽分對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)概率的交互影響（二）
3、腸道微生物群的磷脂代謝產(chǎn)物可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的腸道損傷