我國肉與肉制品產(chǎn)量巨大，2021年人均肉類消費(fèi)量達(dá)到了23.9 kg，產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛。肉品具有較高的水分活度和適宜的pH，極易被微生物污染引起腐敗變質(zhì)。在肉品加工、儲(chǔ)存和零售過程中，微生物是導(dǎo)致肉品腐敗的主要原因，每年給肉類行業(yè)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失。因此，防止或延緩肉品腐敗是全球食品行業(yè)共同關(guān)注的問題，也是近年來食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
芽孢桿菌作為食品中常見的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，廣泛地存在于在各類食品中。國內(nèi)外關(guān)于芽孢桿菌的研究較多，對(duì)芽孢桿菌的形態(tài)、分類等已有較為透徹的研究，研究證明芽孢桿菌是肉制品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一。對(duì)獅子頭中腐敗菌進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在三個(gè)處理組中所占的豐度值為20%左右，是獅子頭腐敗過程中的主要優(yōu)勢(shì)菌。甯雨蕎等在分離市售筍子燒牛肉中的腐敗菌時(shí)發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的致腐能力最強(qiáng)。同時(shí)，芽孢桿菌還具有較強(qiáng)的抗逆性，傳統(tǒng)的巴氏殺菌很難將其殺滅，在后續(xù)合適的環(huán)境條件下會(huì)迅速繁殖，造成食品腐敗變質(zhì)。WEBB等綜述了蠟樣芽孢桿菌在低溫食品中的危害，楊嘯吟等進(jìn)一步論述了不同包裝的冷卻肉腐敗過程中揮發(fā)性氣體與芽孢桿菌等腐敗菌之間的關(guān)聯(lián)，再次表明芽孢桿菌是導(dǎo)致肉類腐敗的主要細(xì)菌。目前針對(duì)芽孢桿菌的研究已證明其為低溫肉制品中腐敗能力較強(qiáng)的腐敗菌，但缺乏對(duì)于肉源性芽孢桿菌不同菌株之間腐敗性能異質(zhì)性的研究。本研究認(rèn)為，分析不同芽孢桿菌之間腐敗性能的差異，是研發(fā)針對(duì)性防控芽孢桿菌污染技術(shù)的基礎(chǔ)。
在微生物污染之后，肉品常見的腐敗特征包括產(chǎn)酸、產(chǎn)氣和發(fā)粘等，這是由微生物多種內(nèi)源酶的氧化分解作用引起的。為了探究不同芽孢桿菌在肉品腐敗中的主要致腐特性，根據(jù)肉品腐敗特征，本研究擬探索6株肉源性芽孢桿菌的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、腐敗酶等特性，為后續(xù)進(jìn)行肉制品中芽孢桿菌針對(duì)性防控提供理論基礎(chǔ)。
1.材料與方法
1.1材料與儀器
試驗(yàn)所用的6株芽孢桿菌均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心提供，分離自低溫香腸，具體見表1；LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、玉米油（脂酶）細(xì)菌微量生化鑒定管、可溶性淀粉瓊脂、盧戈氏碘液等均購于青島海博生物技術(shù)有限公司；干酪素購于北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、95%乙醇均購于上海麥克林生化科技有限公司。
表1 6株芽孢桿菌信息
BIOⅡAdcance4 Sterile GARD生物安全柜西班牙Telstar公司；Scan1200自動(dòng)影像分析菌落計(jì)數(shù)儀法國Interscience公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SQL1010C立式壓力蒸汽滅菌器日本Yamato公司；渦旋振蕩器美國Scilogex公司；Testo 205便攜式pH計(jì)德國Testo公司；M2e酶標(biāo)儀美國MD公司；PD500勻漿機(jī)英國PRIMASCI公司；MUL-9000系列超純水系統(tǒng)美國Milli-Q公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1菌株活化
將6株在?80℃冷凍保存的芽孢桿菌于室溫下進(jìn)行解凍，用接種環(huán)沾取菌液在LB營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，在36±1℃培養(yǎng)24 h后將單菌落挑入LB肉湯中，于36±1℃培養(yǎng)24 h，完成第一次液體擴(kuò)培；取200μL擴(kuò)培菌液移入至新的LB肉湯，于36±1℃培養(yǎng)24 h，完成第二次活化，備用。
1.2.2基本特性
1.2.2.1生長曲線測(cè)定
取0.2 mL活化菌液接種至5 mL的LB肉湯中，分別放在20℃和37℃溫度條件下培養(yǎng)24 h，每3 h取樣測(cè)定600 nm下的吸光度。
1.2.2.2產(chǎn)酸能力測(cè)定
取0.5 mL活化后的菌液接種至5 mL的LB肉湯中，放置于20℃和37℃下培養(yǎng)，在第0、6、12、24、36、48 h取樣，8000×g離心5 min，取上清測(cè)量pH，結(jié)果以不添加菌株的LB肉湯的空白組上清pH數(shù)值減去測(cè)試菌株的上清pH數(shù)值表示。
1.2.2.3產(chǎn)氣能力測(cè)定
在玻璃試管中注入5 mL的LB肉湯并放入Durham管，接種菌液前保證Durham管內(nèi)無氣泡，取0.8 mL活化后的菌液接種至滅菌后的玻璃試管中，用橡膠塞密封；將所有的玻璃試管置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)，在第12、24、36、48和72 h測(cè)量Durham管中的氣柱高度。
1.2.3腐敗酶
1.2.3.1蛋白酶活力測(cè)定
液體法測(cè)蛋白酶參照國標(biāo)《GB/T 23527-2009蛋白酶制劑》中提供的福林法并稍作改良。
活化后的菌液用8500×g離心5 min，上清即為粗酶液。樣品組每管加入0.1 mL酪蛋白溶液，空白組每管加入0.2 mL三氯乙酸溶液，于40±0.2℃的溫度下孵育10 min后用福林溶液顯色，待顯色完全，在680 nm測(cè)定吸光度。制作蛋白酶液體法標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出濃度與吸光度之間的擬合公式為Y=0.0053X?0.0024，擬合度R2>0.99，擬合程度較好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出最終的酶活，單位為U/mL。
固體法測(cè)蛋白酶活力通過觀察菌落在乳粉瓊脂平板和熟雞肉瓊脂平板（cooked-chicken juice agar，CJA）上呈現(xiàn)出的分解圈大小，確定蛋白酶活力強(qiáng)弱。乳粉瓊脂平板制法參考ELEGBELEYE等方法；CJA平板參考王光宇的生雞肉瓊脂平板（raw-chicken juice agar，RJA）法并改進(jìn)。
乳粉瓊脂平板：分別配制15%脫脂牛奶和LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分開滅菌后以1:9的比例混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿制成乳粉瓊脂平板。
CJA：將熟制后的雞胸肉與0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.2）以1:40（W/V）的比例勻漿（6000×g，3 min）；勻漿液過濾后將濾液與等體積的3%瓊脂溶液充分混合，滅菌完成后倒入無菌培養(yǎng)皿制成熟雞肉瓊脂平板。
取活化好的菌液5μL滴加到乳粉瓊脂平板和CJA上，分別放置于20℃和37℃下培養(yǎng)。每24 h觀察記錄菌落生長情況和分解圈形成。
1.2.3.2脂肪酶活力測(cè)定
取活化后的菌液，向脂酶細(xì)菌微量生化鑒定管注入10μL菌液，注入菌液時(shí)盡量使菌液流過鑒定管內(nèi)的培養(yǎng)基斜面，充分與指示劑混合后用封口膜密封生化鑒定管。按照試劑盒說明書，將鑒定管置于37℃培養(yǎng)48 h，并與空白組對(duì)比，觀察顏色變化。
1.2.3.3淀粉酶活力測(cè)定
取活化菌液5μL滴加到淀粉瓊脂平板上，分別放置于20℃和37℃下培養(yǎng)。每24 h取樣，用盧戈氏碘液染色，觀察記錄菌落生長情況和分解圈形成。
1.3數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft office軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示；分解圈面積采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)算；用IBM SPSS Statistics 2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差數(shù)測(cè)驗(yàn)法（LSD）檢驗(yàn)不同處理組之間的顯著性水平（P<0.05），采用Origin2019b作圖。
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