實驗采用龍陵黃山羊耳緣組織塊貼壁培養(yǎng)法首次對龍陵黃山羊成纖維細胞進行體外培養(yǎng)，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍保存建立了龍陵黃山羊耳緣成纖維細胞系；并對其細胞形態(tài)、細胞活率、細胞核型等生物學特性進行了分析。結果表明：細胞倍增時間48 h，生長曲線為“S”型；染色體中正常二倍體染色體2n=60所占比例為91.68%。
龍陵黃山羊為云南省的地方優(yōu)良品種，因其被毛黃色且產于龍陵縣而得名。該品種具有適應性強、耐粗飼的特點，并以肉質細嫩、味美多汁、膻味小而著稱。龍陵縣地處中緬邊境。龍陵黃山羊是在特殊的地理環(huán)境下，經過長期的自然選擇和人工選育形成的。該羊于1987年被列為云南省山羊保種品種之一，目前保種主要采取原產地活體保種的方式，保種方式單一、保種成本高，難以承擔繁重的保種任務。而體細胞建系和冷凍保存技術是解決云南省地方家畜品種遺傳資源保護的有力手段，它不但可以長時間保存優(yōu)良家畜品種遺傳資源，而且結合其他生物技術，如體細胞克隆或轉基因技術，可以加快新品種培育速度，從而提高云南省家畜種質資源創(chuàng)新利用的技術水平。本研究針對此背景，以龍陵黃山羊這一省級保護動物的細胞為研究對象，利用動物細胞培養(yǎng)技術，從染色體水平、形態(tài)學水平進行了研究，并對遺傳種質資源進行了保存。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實驗材料龍陵黃山羊耳樣采自云南省保山市龍陵縣烏木山良種繁育場，試驗用耳樣來源于1月齡龍陵黃山羊耳緣組織。
1.1.2主要試劑、儀器高糖DMEM、胎牛血清（FBS）由Gibco公司生產。青鏈霉素溶液和胰蛋白酶溶液購自Bioind公司；一次性塑料培養(yǎng)皿為Nunclon公司生產。
主要儀器設備：倒置相差顯微鏡（Olympus，Nikon）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；透射電鏡（JEM-1011）；實體顯微（Olympus）；細胞計數(shù)儀；程序降溫盒；液氮罐等。
1.2方法
1.2.1耳緣組織成纖維細胞原代培養(yǎng)選擇健康的龍陵黃山羊耳緣組織刮凈毛，用碘伏消毒后再用75%的酒精擦拭。用滅過菌的耳號鉗取耳緣組織樣本，75%酒精浸泡2min，再用生理鹽水+1%青鏈霉素溶液沖洗3次，然后放入高糖DMEM+1%青鏈霉素溶液中，并放入4℃泡沫箱，24 h內帶回實驗室進行培養(yǎng)。在超凈工作臺上用柳葉刀刮去皮膚表面污物。用含1%青鏈霉素的PBS溶液沖洗4次，再用手術剪剪成碎塊，放入直徑50mm的培養(yǎng)皿中，每皿7～8塊，緩慢加入少量培養(yǎng)液。培養(yǎng)液：高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素。最后放入培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）中培養(yǎng)。每天在倒置相差顯微鏡下觀察、照相、記錄細胞遷移和增殖情況。
1.2.2成纖維細胞傳代
培養(yǎng)當成纖維細胞長至培養(yǎng)皿（瓶）底壁85%左右時，用PBS清洗3次，再用槍頭吸凈培養(yǎng)皿（瓶）里的PBS，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）37℃消化5min左右后，在倒置相差顯微鏡下觀察，當細胞開始變圓并有少量細胞脫落時，加高糖DMEM+15%FBS液終止消化，吹打細胞使其完全脫落，以1∶2或1∶3比例進行傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察傳代細胞生長增殖狀況，并拍照。傳代培養(yǎng)液與原代培養(yǎng)液相同。
1.2.3成纖維細胞冷凍與復蘇細胞冷凍：
0.125%胰酶（含0.01%EDTA）消化收集細胞，1 500 r/min離心5min，棄上清，用高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亞砜（DMSO）凍存液調整細胞濃度為1×107～3×107/mL，充分混勻，分裝在凍存管中。凍存管上標明細胞名稱、凍存管編號、性別和凍存日期。然后放入程序降溫盒中，于-80℃冰箱過夜，次日投入液氮罐中長期保存。
細胞復蘇：從液氮中取出凍存管，迅速投入42℃水浴鍋中，不停搖動使其受熱均勻達1 min，轉移至離心管中離心，棄上清，加入細胞培養(yǎng)液重懸細胞，移至培養(yǎng)皿（瓶）中，在（37℃，5%CO2，飽和濕度）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察復蘇細胞生長狀況，并拍照。
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