1前言
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一。它具有多樣性、復(fù)雜性和高致死率的特點，從全球癌癥發(fā)病率和致死率來看，呈逐年上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，70%的癌癥死亡發(fā)生在低收入和中等收入國家，據(jù)估計，2030年全球癌癥患者將繼續(xù)上升到1100萬。結(jié)腸癌(Colorectal cancer，CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一。近10年來，從全球發(fā)病率和死亡率來看，結(jié)直腸癌的增長速度基本穩(wěn)定，但惡性腫瘤的比例有所上升。結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)具有明顯的地理分布差異，發(fā)達地區(qū)的結(jié)直腸癌發(fā)病率高于欠發(fā)達地區(qū)。目前，天然產(chǎn)物已被公認為具有預(yù)防腫瘤的作用，并有潛力成為化學(xué)預(yù)防和抗癌候選藥物。蠶蛹是一種極具開發(fā)潛力和市場價值的生物資源。它資源豐富，具有極高的營養(yǎng)價值和保健作用，具有增強免疫力、降低血糖、延緩衰老等作用。可通過降低氧化作用顯著促進脂肪代謝和神經(jīng)保護功能。Lee等人研究表明，它可以阻止前脂肪細胞的形成，未來可用于治療飲食性肥胖。日本、韓國等國家已將蠶蛹列為營養(yǎng)食品，在食品領(lǐng)域具有廣闊的市場發(fā)展前景。
2方法
（1）細胞培養(yǎng)條件
細胞(由中國科學(xué)院類型培養(yǎng)庫細胞庫提供)在含10%胎牛血清和1%抗體(100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素)的rmii-1640培養(yǎng)基中，在37℃的5%CO2飽和濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化使細胞匯合至80%-90%，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。
（2）CCK-8測定細胞密度
5000細胞/100μL于96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)5%二氧化碳培養(yǎng)箱在37°C 24 h。100μL(SPP(0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0毫克/毫升)被添加到每個好,復(fù)制和6井為每個組在37°C和5%二氧化碳孵化器孵化后24 h。24小時孵化飽和濕度下,100μL介質(zhì)含有10%CCK-8被添加到每個好,和額外的細胞進一步孵化1 h,并在450nm處記錄吸光度。
（3）細胞凋亡檢測
取2毫升(1×105個細胞/mL)對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2孵育24 h，待細胞生長至融合狀態(tài)后，棄用培養(yǎng)基，分別用0、0.8、1.6、2.4和3.2 mg/mL的SPP處理各組。細胞培養(yǎng)箱在37℃、5%CO2條件下加濕培養(yǎng)24 h，采用流式細胞儀(Becton,Dickinson and Company,USA)檢測ddd-1細胞凋亡率。
（4）實驗條件優(yōu)化
①優(yōu)化細胞數(shù)量
胰酶消化后收集對數(shù)生長期DLD-1細胞，離心重懸。分別在Seahorse XFe24細胞外通量分析儀(Agilent Biosciences,Santa Clara,CA,USA)、細胞培養(yǎng)板上每孔添加250μL細胞懸液，使細胞數(shù)量分別達到1×104、2×104、4×104、8×104(5個重復(fù))。
②羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)
在確定細胞數(shù)量后，通過配置不同濃度的FCCP來運行檢測。
③線粒體應(yīng)激和糖酵解應(yīng)激試驗
通過添加寡霉素、FCCP和魚藤酮/抗霉素A測定耗氧率(OCR)。
測定不同時間點的OCR值，反映細胞氧化磷酸化水平。細胞產(chǎn)酸速率反映了細胞的糖酵解速率，通過添加葡萄糖、寡霉素和2-脫氧d-葡萄糖(2-DG)來測定細胞糖酵解速率的變化，并測定不同時間點的產(chǎn)酸速率。
3結(jié)果與討論
（1）SPP可抑制DLD-1細胞的侵襲行為
不同濃度SPP處理24 h后，DLD-1細胞生長受到不同程度的抑制，細胞活力隨著SSP濃度的增加而逐漸降低，呈劑量依賴性(圖1)。與對照組相比，各劑量組細胞活力差異均極顯著(P<0.01)。在后續(xù)實驗中，如果SPP濃度過高，則細胞存活率過低。在流式細胞儀和能量代謝檢測細胞時，由于細胞碎片的影響，在后續(xù)實驗中去除4 mg/mL劑量組。
圖1 CCK-8分析評估細胞增殖
**與對照組相比P<0.01
（2）SPP誘導(dǎo)DLD-1細胞凋亡
為了進一步確定SPP對DLD-1細胞的誘導(dǎo)凋亡作用，利用Annexin V-FITC/PI對DLD-1細胞進行染色，發(fā)現(xiàn)凋亡細胞數(shù)量隨著SPP濃度的增加而顯著增加(圖2A)。早期和晚期細胞凋亡比例呈劑量依賴性增加，分別從0.08%增加到7.37%和2.83%增加到23.45%(圖2B)。提示SPP可能通過破壞質(zhì)膜完整性誘導(dǎo)DLD-1細胞凋亡。
圖2 LD-1細胞凋亡變化
(A)DLD-1細胞用碘化丙啶(PI)染色，流式細胞法檢測，(A1?A5)SPP分別為0、0.8、1.6、2.4和3.2 mg/mL；
(B)細胞凋亡的定量分析
**P<0.01，*P<0.05
（3）DLD-1細胞能量代謝的變化
在進行線粒體應(yīng)激測試時，細胞密度對細胞OCR值的測定有很大影響。在本文中，我們發(fā)現(xiàn)OCR值隨著加入不同數(shù)量的單元格而增加。為了保證測試信號的準(zhǔn)確性和靈敏度，根據(jù)Seahorse XFe24細胞外通量分析儀的說明，在使用24孔生物能量分析儀測定細胞OCR時，正常生長狀態(tài)的細胞的OCR應(yīng)在50-400 pmol/min范圍內(nèi)，并在細胞中添加與24孔生物能量分析儀相同數(shù)量的細胞。密度應(yīng)在1×104-8×104 cells/well之間。因此，適宜將細胞維持在8×104(圖3A-B)。
圖3 DLD-1細胞數(shù)量及FCCP梯度濃度對OCR的影響
(A)不同細胞密度下DLD-1細胞的OCR；(B)不同細胞密度下的基礎(chǔ)呼吸速率；(C)FCCP梯度濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2μmol/L)處理DLD-1細胞的OCR；(D)梯度濃度FCCP處理細胞的最大呼吸速率
不同字母表示差異極顯著(P<0.01)
FCCP是一種解偶聯(lián)劑，可降低細胞耗氧量和ATP合酶偶聯(lián)，增加耗氧量，并作為質(zhì)子載體。因此，它可以回流大量的質(zhì)子，導(dǎo)致細胞耗氧量增加。由于電子轉(zhuǎn)移和氧化磷酸化解耦，高濃度的FCCP會對細胞產(chǎn)生毒性，最終導(dǎo)致細胞死亡，因此選擇合適的工作濃度很重要。在本研究中，細胞經(jīng)寡霉素(一種氧化磷酸化抑制劑)處理后，OCR下降，在細胞混合物中加入不同濃度的FCCP來檢測OCR的變化。結(jié)果表明，隨著FCCP濃度的增加，細胞OCR呈增加趨勢，在1μmol/L時達到最大值，而當(dāng)FCCP濃度增加到2μmol/L時，細胞最大耗氧速率水平并沒有顯著提高(圖c3-d)，說明FCCP的最佳工作濃度為1μmol/L。
提出SPP可抑制結(jié)腸癌DLD-1細胞增殖，促進細胞凋亡。本研究采用Bioenergetics Analyzer測量SPP處理后細胞的OCR，并分析相關(guān)參數(shù)，以確定SPP對細胞氧化磷酸化過程的影響。隨著SPP處理濃度的增加，整體細胞OCR顯著降低，尤其是在生長期，F(xiàn)CCP處理后細胞OCR顯著降低(圖4A)。上述4種氧化磷酸化和電子轉(zhuǎn)移鏈調(diào)節(jié)處理使DLD-1細胞的基礎(chǔ)呼吸和ATP產(chǎn)量逐漸降低(P<0.01)。與對照組相比，spp處理后的細胞基礎(chǔ)呼吸分別下降22.66%、39.38%、61.27%和65.77%(圖4B)，ATP產(chǎn)量分別下降20.88%、37.73%、45.91%和50.28%(圖4C)。
不同劑量SPP對人結(jié)腸癌DLD-1細胞能量代謝的影響（一）
不同劑量SPP對人結(jié)腸癌DLD-1細胞能量代謝的影響（二）
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