圖4 DLD-1細(xì)胞線粒體呼吸變化
(A)SPP(0、0.8、1.6、2.4、3.2 mg/mL)處理后細(xì)胞OCR的總體曲線；(B)SPP處理后細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸；(C)SPP處理對(duì)細(xì)胞A-TP產(chǎn)生的影響；(D)對(duì)照組和SPP預(yù)處理細(xì)胞的最大呼吸量；(E)對(duì)照組和SPP預(yù)處理細(xì)胞的呼吸變化
**與對(duì)照組相比P<0.01
隨著SPP濃度的增加，DLD-1細(xì)胞的呼吸作用和輔助呼吸作用逐漸減弱(P<0.01)。與對(duì)照組相比，spp處理后細(xì)胞的最大呼吸分別降低了56.81%、87.27%、154.69%和170.70%(圖4D)，輔助呼吸分別降低了34.15%、47.89%、88.92%和109.40%(圖4E)。這說(shuō)明SPP在很大程度上抑制了細(xì)胞線粒體能量代謝過(guò)程。
Warburg等發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)切換代謝途徑來(lái)適應(yīng)缺氧環(huán)境，腫瘤細(xì)胞糖酵解速率增加就是證明，即使在回到常氧條件后，腫瘤細(xì)胞仍繼續(xù)依賴(lài)糖酵解來(lái)產(chǎn)生能量。這個(gè)代謝過(guò)程被定義為好氧糖酵解。生物能量分析儀能夠研究細(xì)胞的耗氧速率，可應(yīng)用于細(xì)胞糖酵解的研究。本研究采用Bioenergy Analyzer測(cè)定SPP處理后細(xì)胞糖酵解的變化，探討SPP對(duì)細(xì)胞糖酵解的影響。
隨著SPP濃度的增加，細(xì)胞糖酵解過(guò)程明顯受到抑制，細(xì)胞外酸化率(ECAR)整體水平明顯降低(圖5A-B)，表現(xiàn)為基礎(chǔ)糖酵解逐漸降低速率，細(xì)胞糖代謝速率，最大糖酵解速率和剩余糖酵解能力。與對(duì)照組相比，SPP處理組的基礎(chǔ)糖酵解率分別降低4.58%、5.70%、7.68%、8.01%(圖5C)，細(xì)胞糖代謝率分別降低20.19%、30.37%、39.21%、72.72%(圖5D)，最大糖酵解分別降低26.16%、38.40%、40.79%、62.46%(圖5E)，備用糖酵解能力分別降低20.11%、28.17%、63.50%、68.77%(圖5F)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上結(jié)果表明，SPP可顯著降低細(xì)胞糖酵解水平。
圖5 DLD-1細(xì)胞有氧糖酵解調(diào)節(jié)的變化
(A)SPP預(yù)處理細(xì)胞整體ECAR曲線；(B)A放大46.5-73.0 min；(C)對(duì)照和SPP預(yù)處理細(xì)胞的基礎(chǔ)糖酵解率；(D)SPP處理前后DLD-1細(xì)胞糖酵解轉(zhuǎn)化能力；(E)對(duì)照組和SPP預(yù)處理后DLD-1細(xì)胞最大糖酵解速率；(F)SPP處理后DLD-1細(xì)胞剩余糖酵解能力的改變
**與對(duì)照組相比P<0.01
4結(jié)論
結(jié)直腸癌是全球第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率最高(10.2%)，其發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)國(guó)家和經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型國(guó)家之間差異很大。根據(jù)美國(guó)癌癥研究所(AICR)和世衛(wèi)組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌是男性第三大常見(jiàn)癌癥，女性第二大常見(jiàn)癌癥，2018年全球新發(fā)病例超過(guò)180萬(wàn)例，預(yù)計(jì)到2030年全球結(jié)直腸癌負(fù)擔(dān)將增加60%。癌癥治療后，如化療、手術(shù)和放射治療，普遍存在潛在的或嚴(yán)重的毒副作用。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新型有效、無(wú)毒的抗腫瘤藥物。近年來(lái)，天然藥物在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用。各種具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)或多肽已被研究用于與化療藥物的聯(lián)合抗腫瘤作用。與抗癌藥物相比，具有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽是首選，因?yàn)樗鼈儧](méi)有致畸作用，沒(méi)有累積毒性，不容易導(dǎo)致耐藥。在本研究中，一定濃度的SPP可顯著抑制DLD-1細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并呈劑量依賴(lài)性。
細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，是正常生物清除衰老和不功能細(xì)胞，維持正常細(xì)胞代謝平衡的防御機(jī)制，在細(xì)胞的多種功能中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)特征有:凋亡啟動(dòng)后細(xì)胞形態(tài)呈圓形，隨后細(xì)胞黏附消失，細(xì)胞間連接斷開(kāi)，細(xì)胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)濃縮高密度，核裂解，核內(nèi)出現(xiàn)典型的空泡結(jié)構(gòu)，核膜復(fù)雜，凋亡小體晚期分裂為多個(gè)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡除了作為正常生理過(guò)程發(fā)生外，體外環(huán)境因素也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，細(xì)胞內(nèi)線粒體的這種調(diào)節(jié)功能的關(guān)閉導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不足和細(xì)胞過(guò)度增殖。
當(dāng)細(xì)胞凋亡被阻斷，導(dǎo)致平衡被破壞時(shí)，這反過(guò)來(lái)為腫瘤的形成奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果表明，SPP可誘導(dǎo)結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞的快速增殖將耦合對(duì)能量的更大需求，因此，針對(duì)腫瘤的生物能量代謝已成為癌癥治療的一種新的有效預(yù)防途徑，高效完整地研究分子或藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞能量代謝的影響已成為主要問(wèn)題。生物能量分析儀采用固態(tài)探針和獲得專(zhuān)利的瞬時(shí)微室技術(shù)，實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確、無(wú)損地檢測(cè)細(xì)胞能量代謝狀態(tài)，可以同時(shí)測(cè)量細(xì)胞中兩種主要的能量代謝途徑——線粒體呼吸和糖酵解。細(xì)胞能量代謝的主要指標(biāo)，如基礎(chǔ)呼吸、ATP生成、最大呼吸、基礎(chǔ)糖酵解速率、最大糖酵解速率、備用糖酵解能力等，為細(xì)胞能量代謝的測(cè)定提供了一種新的、方便、快速的方法。
在本研究中，SPP對(duì)基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、儲(chǔ)備呼吸和ATP轉(zhuǎn)換表現(xiàn)出劑量依賴(lài)的抑制作用，但劑量效應(yīng)關(guān)系可能是非線性的。這種下降可能是由于SPP處理細(xì)胞的凋亡狀態(tài)和活性氧(ROS)水平的增加可能引起細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而降低線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，影響線粒體ATP合成能力，高劑量(3.2 mg/mL)SPP對(duì)細(xì)胞線粒體有氧/氧化活性的影響。這可能與線粒體能量代謝紊亂直接相關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。糖酵解能在缺氧條件下迅速為細(xì)胞提供能量。結(jié)果表明，SPP可降低DLD-1細(xì)胞的糖酵解，影響其糖酵解功能，但損害程度低于基礎(chǔ)耗氧率和有氧呼吸最大值的降低，提示SPP對(duì)細(xì)胞能量代謝的主要影響是由于線粒體功能的損害。
綜上所述，本文主要研究了不同劑量SPP對(duì)人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞能量代謝的影響。其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。海馬XFe24細(xì)胞能量代謝分析儀可靈敏檢測(cè)基礎(chǔ)有氧呼吸速率、ATP耦合有氧呼吸速率等指標(biāo)的變化。為SPP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死提供了可行性，但能否應(yīng)用于臨床治療尚需進(jìn)一步探索。
不同劑量SPP對(duì)人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞能量代謝的影響（一）
不同劑量SPP對(duì)人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞能量代謝的影響（二）
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