3.TmFae-PETase和已報道PET水解酶的PET降解能力比較
系統(tǒng)進化分析中發(fā)現(xiàn)TmFae-PETase與FsC在同一分支（圖3a）。TmFae-PETase能降解PET塑料并其轉(zhuǎn)化為MHET和TPA等產(chǎn)物（圖3b）。為評估TmFae-PETase的PET水解能力，將其與已報道的PET水解酶進行功能比較，從系統(tǒng)發(fā)育樹的每個分支上選擇一個代表性的PET水解酶，分別是IsPETase、FsC和LCC。TmFae-PETase、IsPETase、FsC和LCC對PET降解結(jié)果表明，在35℃下TmFae-PETase的PET降解能力高于FsC，而低于IsPETase和LCC。然而，IsPETase的PET降解活性在反應(yīng)3天后下降，說明其在較長時間下穩(wěn)定性差。反應(yīng)7天后，TmFae-PETase降解PET時所釋放的產(chǎn)物MHET和TPA的濃度與IsPETase的幾乎相等（圖3e）。TmFae-PETase對PET塑料的降解能力隨時間而增高，在反應(yīng)10天后，降解產(chǎn)物MHET的濃度高于其他酶，而LCC的PET降解產(chǎn)物TPA濃度最高（圖3c）。在50℃下，TmFae-PETase的PET降解能力高于35℃，降解產(chǎn)物MHET和TPA的濃度高于IsPETase和FsC，但低于LCC（圖d，f）。在較高的溫度，TmFae-PETase和LCC的PET降解產(chǎn)物TPA的濃度高于MHET。TmFae-PETase具有水解MFA和MCA能力，已知的其它PET降解酶是否具有水解這兩種底物的能力還待探索。如圖3（g,h）所示，IsPETase和LCC對MFA的水解活性高于TmFae-PETase，而TmFae-PETase和IsPETase對MCA的水解活性最高。
圖3.TmFae-PETase與已知PET水解酶的活性比較。(a)基于TmFae-PETase和已知PET水解酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹;(b)HPLC檢測PET降解產(chǎn)物MHET和TPA;(c,d)TmFae-PETase、FsC、IsPETase和LCC在PET降解過程中分別釋放TPA和MHET產(chǎn)物的量;(e,f)TmFae-PETase、FsC、IsPETase和LCC在35°C和50°C下水解PET的總釋放產(chǎn)物(MHET和TPA);(g,h)TmFae-PETase和已知PET水解酶在35℃下MFA和MCA水解過程中分別釋放FA和CA產(chǎn)物的量。
4.基于定點誘變和MD模擬的TmFae-PETase催化機制
TmFae-PETase的結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示存在8個α螺旋和7個β折疊，與阿魏酰酯酶LP_0796（PDB：7EBO）高度相似，基于190個Cα原子的均方根差（RMSD）為0.582?。均方根波動（RMSF）分析確定了四個具有顯著靈活性的區(qū)域，標(biāo)記區(qū)域為A-D，尤其是在活性位點和TmFae-PETase的額外α螺旋周圍（圖4a、b）。這種靈活性，特別是在區(qū)域B（最大RMSF為1.70?）和D（最大RMSF為1.40?）以及活動位點環(huán)區(qū)域A（最大RMSF為0.97?）中，有助于底物的進出。盡管存在額外的螺旋結(jié)構(gòu)，但TmFae-PETase仍能有效降解PET。TmFae-PETase與PET二聚體的分子對接表明，殘基Y26和M97促進了關(guān)鍵的氫鍵相互作用，殘基S96、D196和H226起催化作用（圖4c）。針對該酶的18個關(guān)鍵位點進行了定點突變實驗，結(jié)果顯示14個突變體導(dǎo)致PET水解活性降低了30%~80%。特別是，突變體S96A、D196A（不溶性蛋白）、H226A、Y26A和M97A顯示PET、MFA、MCA和p-NPB水解顯著降低（圖4d），表明這些殘基對于維持TmFae-PETase的活性至關(guān)重要，可能以類似的模式形成PET、MFA、MCA和p-NPB的底物結(jié)合位點。相反，只有三個突變體，即L95W、P122W和P125A顯著提高了PET降能力。值得注意的是，在50°C時，L95W降解PET釋放的MHET和TPA產(chǎn)量比WT高兩倍。此外，這三種突變體引起的二級結(jié)構(gòu)變化很?。▓D4h），并且對Tm值（72.5–75.9°C）沒有顯著影響（圖4i）。為了進一步研究突變?nèi)绾斡绊懨傅腜ET水解活性，分析了TmFae-PETase活性位點周圍的環(huán)，特別是通過模型預(yù)測檢查了由三個突變體（L95W、P122W和P125A）和WT引起的相互作用模式的變化（圖4f）。通過將L95和P122突變?yōu)槭杷园被醀，該酶的疏水性以及與PET的π-π相互作用增加。與WT相比，L95W、P122W和P125A的C區(qū)和D區(qū)的RMSF值較低（圖4g），表明結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強。四個疏水殘基Y26、M95、W122和W125）似乎顯著影響WT或突變形式的結(jié)合親和力。L95W和P122W與PET二聚體的結(jié)合親和力強于WT，表明它們在增強底物結(jié)合親和力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖4.基于定點誘變和MD模擬的TmFae-PETase催化機制。（a）具有PET復(fù)合物系統(tǒng)的TmFae-PETase的RMSF，用不同顏色突出顯示與活性位點區(qū)域相對應(yīng)的峰;（b）TmFae-PETase的晶體結(jié)構(gòu)顯示為卡通（淺黃色），TmFae-PETase上A-D區(qū)的配色方案對應(yīng)于圖a中所示的相同圖案;（c）使用PET二聚體的TmFae-PETase殘基Y26和M97之間的氫鍵距離;（d，e）WT和TmFae-PETase突變體在35°C和50°C時的PET水解活性;（f）WT和突變體（95W、125A和122W）的特異性駐留（L95、P125和P122）替換的結(jié)構(gòu)分析，其中WT為黃色，突變體為淺粉紅色;（g）WT與突變體L95W、P122W和P125A的RMSF比較，每個系統(tǒng)包括蛋白質(zhì)和PET二聚體;（H，I）TmFae-PETase和突變體L95W、P125A和P122W的CD色譜圖和Tm。注意：WT=野生型。
5.優(yōu)化TmFae-PETase的PET降解能力
為了探索PET降解的最佳條件，研究了pH值、溫度和鹽度對TmFae-PETase的影響。在60°C時，TmFae-PETase表現(xiàn)出最高的PET水解活性，與30°C相比，MHET和TPA的總量增加了160倍（圖5a）。該溫度與PET的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（≈70°C）非常相似，這有利于PET的酶促降解。結(jié)果表明，溫度對TmFae-PETase有明顯影響。在pH 8.0時觀察到TmFae-PETase的最大PET水解活性，導(dǎo)致總MHET和TPA的量比pH 7.0和10.0時高出五倍（圖5b）。同樣，IsPETase、FsC和LCC的PET水解活性的最佳pH值在8.0至9.0之間。即使酶濃度超過1.0μM，TmFae-PETase的PET水解活性也保持穩(wěn)定（圖5c）。然而，反應(yīng)5天后，PET水解活性在2.0μM的酶濃度下增強，表明較長的處理持續(xù)時間需要更高的酶濃度。TmFae-PETase在0至10 mM的鹽濃度范圍內(nèi)顯示出最佳的PET水解活性，隨著NaCl濃度的增加，活性逐漸降低（圖5d）。PET劑量測試顯示，在50°C下，TmFae-PETase的水解活性在PET濃度為50 mg·mL–1下進入穩(wěn)定期，解聚速率為0.7 mgMHETeq h–1·mg酶–1和0.2 mgTPAeq h–1·mg酶–1（圖5e）。高溫條件下，MHET和TPA的產(chǎn)量隨著與TmFae-PETase反應(yīng)時間的進行而增加（圖5f），表明該酶在較長時間內(nèi)保持高穩(wěn)定性。
圖5.通過TmFae-PETase優(yōu)化PET降解的操作參數(shù)表征。（a）溫度對TmFae-PETase水解PET的影響;（b）pH值對30°C時PET降解的影響;（c）在30°C下，不同酶濃度在第2天和第5天釋放的累積產(chǎn)物濃度;（d）鹽度（NaCl）對30°C下PET水解的影響;（e）TmFae-PETase在50°C下對各種濃度的PET的特異性水解活性;（f）30°C和50°C下產(chǎn)物釋放的時間進程比較（初始PET濃度為6 mg·L–1酶0.7μM）。
6.TmFae-PETase對消費后PET（Pc-PET）廢物的解聚
為評價TmFae-PETase的實際應(yīng)用，收集飲料瓶（1#、2#）、食品包裝（3#、4#、5#）和6孔板包裝（6#）六類pc-PET廢棄物，評價TmFae-PETase及其突變體L95W的性能。兩種酶都可以降解所有測試的pc-PET廢物。然而，與飲料瓶pc-PET廢料（1#、2#）相比，它們對3#、4#、5#和6#型表現(xiàn)出卓越的降解能力（圖6a）。其水解產(chǎn)物MHET和TPA的濃度比pc-PET瓶廢料（1#和2#）的濃度高200倍以上（圖6c）。目視和SEM觀察表明，用TmFea-PETase處理的pc-PET廢物表面變得不透明，形成明顯的孔洞，而未經(jīng)酶處理的pc-PET保持光滑透明（圖6d）。飲料瓶pc-PET 1#和2#的結(jié)晶度分別為18.3%和34.1%，而包裝#3至#6的pc-PET結(jié)晶度相對較低，低于12.0%（圖6b）。pc-PET 1#和2#的Mn和Mw分別為29300和32200 Da，以及53900和53300 Da，高于#3至#6的pc-PET廢物類型，Mn范圍分別為17100至26400 Da，分子量范圍分別為37300至47000 Da，導(dǎo)致瓶pc-PET的酶降解效率較低（圖6e，f）。
圖6.野生型TmFae-PETase和突變體L95W的性能比較。（a）WT和L95W根據(jù)產(chǎn)物釋放濃度（μM）降解六種類型的pc-PET廢物;（b）通過XRD分析確定的6種pc-PET廢物的結(jié)晶度;（c）WT和L95W在pc-PET廢料水解過程中釋放的MHET和TPA產(chǎn)物的量;（d）未經(jīng)處理的pc-PET和TmFae-PETase處理的PET廢物#至6#表面形貌的SEM觀察;（e，f）pc-PET廢料的酶降解、結(jié)晶度和分子量之間的相關(guān)性。注意：WT=野生型TmFae-PETase;L95W=突變體L95W。
本研究引入了一種從黃粉蟲的塑料降解腸道微生物組中篩選塑料降解酶的創(chuàng)新方法，從而擴大了現(xiàn)有的塑料降解酶庫。此外，這些發(fā)現(xiàn)還有助于了解昆蟲的腸道微生物群降解木質(zhì)纖維素如何作為篩選塑料降解酶的潛在候選者的寶貴資源。這種相關(guān)性突出了木質(zhì)纖維素和塑料降解之間潛在的交叉功能，為酶的發(fā)現(xiàn)及其在解決塑料廢物管理方面的應(yīng)用開辟了新的可能性。
新篩選PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳條件、實際應(yīng)用（一）
新篩選PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳條件、實際應(yīng)用（二）
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