2結(jié)果與討論
2.1 SCRS數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
本文應(yīng)用HOOKE intP軟件對實(shí)驗(yàn)組和驗(yàn)證組同步培養(yǎng)的SCRS數(shù)據(jù)進(jìn)行批處理。在實(shí)驗(yàn)組(大腸桿菌)中，1、2、…、14 h每個培養(yǎng)時間點(diǎn)各采集100個SCRS數(shù)據(jù)，依據(jù)圖1中OD600生長曲線分別將1和2 h、3和4 h、6和14 h采集的大腸桿菌SCRS數(shù)據(jù)對應(yīng)到lag phase、log phase和stationary phase三個生長時期標(biāo)簽，每個生長時期200個數(shù)據(jù)。用堆疊圖(stacked lines by Y offsets)顯示三個生長時期SCRS數(shù)據(jù)預(yù)處理效果，如圖2(a)所示，分別以實(shí)線和陰影部分顯示三個生長時期200個SCRS數(shù)據(jù)平均值和方差，橫坐標(biāo)為拉曼位移(cm-1)，由于微生物生長過程中的異質(zhì)性較為穩(wěn)定，表現(xiàn)出三個生長時期光譜具有較低的方差。對三組大腸桿菌的SCRS數(shù)據(jù)做探索性數(shù)據(jù)分析(EDA)，分別用圖2(b)密度圖和圖2(c)帶抖動點(diǎn)的箱線圖觀測三組數(shù)據(jù)信噪比(SNR)分布情況，其中l(wèi)ag phase光譜信噪比均值和方差為4.97±1.54，log phase光譜信噪比4.74±1.17，stationary phase光譜信噪比4.84±1.21，三個生長時期SCRS數(shù)據(jù)特征呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的均勻分布，保證了預(yù)期檢測結(jié)果不受SNR影響。
圖2大腸桿菌不同生長時期SCRS數(shù)據(jù)預(yù)處理效果
(a):拉曼光譜堆疊圖;(b):SNR的密度直方圖;(c):帶有抖動點(diǎn)的箱線圖
2.2基于譜聚類與SCRS的細(xì)胞生長檢測
基于譜聚類與SCRS的細(xì)胞生長檢測結(jié)果建立在1.3方法的基礎(chǔ)上，在t-SNE方法中，嵌入空間維度(n_components)選擇為2維，譜聚類的相似度計算方法(affinity)選用最近鄰算法，聚類評估中聚類簇數(shù)(n_clusters)最大值為9簇。
2.2.1實(shí)驗(yàn)組聚類和評估
對實(shí)驗(yàn)組600個(6個培養(yǎng)時間點(diǎn)各采集100個SCRS數(shù)據(jù))大腸桿菌SCRS數(shù)據(jù)聚類分析，首先，將高維的SCRS數(shù)據(jù)應(yīng)用t-SNE投影到二維平面，見圖3(a)中，用不同形狀、顏色散點(diǎn)標(biāo)記同步培養(yǎng)的1、2、3、4、6和14 h等6個生長時期標(biāo)簽的大腸桿菌群體細(xì)胞;其次，基于圖3(a)的散點(diǎn)分布結(jié)果，應(yīng)用譜聚類對平面上SCRS數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，見圖3(c)中，(c)左下折線圖為應(yīng)用輪廓系數(shù)(S_C)和CH index(C—H)對譜聚類在大腸桿菌SCRS數(shù)據(jù)集上劃分的簇數(shù)和聚類質(zhì)量的評估得分折線圖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)聚為3簇時達(dá)到最佳聚類效果，沿著TSNE1和TSNE2坐標(biāo)分布顯示了3個清晰可分離的簇，聚類中心(紅色圓點(diǎn))到簇內(nèi)和其他聚類中心平均距離(從左到右):(13.86，40.16)，(14.16，56.31)，(13.98，58.52);最后，應(yīng)用三次樣條插值擬合統(tǒng)計SCRS數(shù)據(jù)簇標(biāo)簽和OD600生長時期標(biāo)簽交集，圖3(b)中有效識別60個異質(zhì)SCRS數(shù)據(jù)，占總SCRS數(shù)量的9%。
圖3應(yīng)用譜聚類檢測大腸桿菌細(xì)胞生長時期結(jié)果
(a):實(shí)驗(yàn)組SCRS的散點(diǎn)分布;(b):三次樣條插值擬合效果;(c):SCRS的聚類和評估
2.2.2驗(yàn)證組聚類和評估
用驗(yàn)證組的300個(6個培養(yǎng)時間點(diǎn)各采集50個SCRS數(shù)據(jù))枯草芽孢桿菌SCRS數(shù)據(jù)驗(yàn)證方法適用性，應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)組相同的預(yù)處理方法，對三組枯草芽孢桿菌的SCRS數(shù)據(jù)做EDA分析，lag phase、log phase和stationary phase光譜信噪比均值和方差分別為:5.35±0.67、4.85±0.77、5.9±1.01，滿足數(shù)據(jù)質(zhì)量評估。圖4(a)為同步培養(yǎng)下1、2、3、5、8和14 h等6個時期枯草芽孢桿菌SCRS數(shù)據(jù)經(jīng)t-SNE壓縮后的平面分布;圖4(c)輪廓系數(shù)(S_C)和CH index(C—H)聚類評估得分顯示，不同生長時期的芽孢桿菌同樣聚為3簇時達(dá)到最佳聚類效果，各聚類中心到簇內(nèi)和其他聚類中心平均距離(從左到右):(11.82，34.23)，(10.23，51.47)，(10.01，48.09);圖4(b)同樣應(yīng)用三次樣條插值擬合統(tǒng)計SCRS數(shù)據(jù)簇標(biāo)簽和OD600生長時期標(biāo)簽交集，檢測出13個不同生長時期異質(zhì)SCRS數(shù)據(jù)，占總SCRS數(shù)量的4.3%。
圖4應(yīng)用譜聚類檢測枯草芽孢桿菌細(xì)胞生長時期結(jié)果
(a):驗(yàn)證組SCRS的散點(diǎn)分布;(b):三次樣條插值擬合效果;(c):SCRS的聚類和評估
實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證結(jié)果表明，基于譜聚類與SCRS的細(xì)胞生長分析方法只需要借助同步培養(yǎng)的群體細(xì)胞OD600生長曲線和給定相似度計算方法就可以直接根據(jù)SCRS數(shù)據(jù)特征進(jìn)行建模，能有效檢測微生物群體中不同生長時期共存的單細(xì)胞信息，真正意義上實(shí)現(xiàn)從單細(xì)胞尺度精準(zhǔn)檢測細(xì)胞生長時期。
3結(jié)論
單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)以快速、靈敏和無標(biāo)記的優(yōu)勢可以實(shí)時監(jiān)測單細(xì)胞的生長代謝變化，以監(jiān)督學(xué)習(xí)為代表的模式識別技術(shù)往往需要精準(zhǔn)的監(jiān)督標(biāo)簽，然而由于細(xì)胞異質(zhì)性，同步培養(yǎng)的群體細(xì)胞OD600生長曲線無法作為每個單細(xì)胞生長時期標(biāo)簽。本文將SCRS技術(shù)和無監(jiān)督聚類技術(shù)相結(jié)合，為單細(xì)胞微生物生長檢測研究提供新的檢測方法，基于譜聚類無需標(biāo)記就可以直接根據(jù)SCRS數(shù)據(jù)特征進(jìn)行建模，并能夠?qū)θ我庑螤畹母呔SSCRS數(shù)據(jù)聚類且快速收斂的優(yōu)勢，對發(fā)酵工程菌和發(fā)酵益生菌細(xì)胞滯后期、對數(shù)期和穩(wěn)定期的精準(zhǔn)識別，實(shí)現(xiàn)了真正意義上從單細(xì)胞水平上檢測細(xì)胞生長，為發(fā)酵工程提供更加精準(zhǔn)、實(shí)時的調(diào)控指導(dǎo)，具有重要的工程應(yīng)用價值。
單細(xì)胞微生物生長時期精準(zhǔn)鑒定與實(shí)時監(jiān)測方法（一）
單細(xì)胞微生物生長時期精準(zhǔn)鑒定與實(shí)時監(jiān)測方法（二）
相關(guān)新聞推薦
1、禽呼腸病毒S1133毒株接種DF1細(xì)胞一步生長曲線的繪制——材料與方法