摘要
本研究旨在從健康北極狐腸道中分離和鑒定具有益生菌潛能的乳酸菌，并對(duì)其體外益生功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化和16S rRNA鑒定，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸和耐酸曲線，測(cè)定該菌的膽鹽耐受性以及在人工胃液和人工腸液中的存活率，分別采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法和紙片擴(kuò)散法檢測(cè)該菌的抗菌活性和抗生素敏感性。最后選取20只雌性昆明小鼠，隨機(jī)分為2組(每組10只)，對(duì)照組灌胃生理鹽水，試驗(yàn)組灌胃唾液乳桿菌(1×109 CFU/mL)，試驗(yàn)期7 d。結(jié)果表明:結(jié)合16S rRNA和生理生化鑒定結(jié)果將其命名為唾液乳桿菌ZJBF005，該菌在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力;在pH 4~7培養(yǎng)液之間生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)液pH低于2生長(zhǎng)受到抑制;在人工胃液、人工腸液中培養(yǎng)3 h后的存活率分別為40.96%和86.70%;可在0.2%的膽鹽環(huán)境中生長(zhǎng);可抑制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng);對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素、磷霉素、阿奇霉素、甲氧芐啶和甲硝唑等抗生素不敏感;灌胃后的小鼠體重變化正常、無(wú)死亡、剖檢無(wú)病理性變化。綜上所述，來(lái)自健康北極狐腸道的唾液乳桿菌ZJBF005具有良好的益生菌特性，可作為益生菌的備選菌株。
益生菌是一種活的微生物，當(dāng)給予足夠的劑量時(shí)，會(huì)對(duì)宿主的健康產(chǎn)生良好的影響。在人類中用于預(yù)防和治療疾病、傳染性和非傳染性疾病，并在家禽、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖中有廣泛的應(yīng)用。對(duì)于性能良好的益生菌來(lái)說(shuō)，其在口腔溶菌酶、胃pH和腸膽汁等酸性環(huán)境中的生存能力是一個(gè)重要因素。益生菌的抑菌活性、抗炎活性和增強(qiáng)上皮細(xì)胞免疫屏障功能也是優(yōu)異益生菌所要具備的關(guān)鍵因素。
北極狐為犬科動(dòng)物，目前對(duì)其腸道微生物的研究較少。前期研究表明，北極狐腸道存在復(fù)雜的微生物區(qū)系，在北極狐營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化利用、維護(hù)機(jī)體健康和免疫功能方面發(fā)揮重要作用。本項(xiàng)目組已在健康北極狐腸道中分離獲得多種益生性能良好的益生菌。來(lái)自特定宿主的益生菌能更好地適應(yīng)該宿主的環(huán)境。因此，本試驗(yàn)旨在從健康北極狐腸道中分離和鑒定具有益生菌潛能的乳酸菌，并對(duì)其體外益生功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
1、材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1樣品采集
2021年11月20日于長(zhǎng)白山野生生物資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站采集24只冬毛期健康北極狐的腸道內(nèi)容物。
1.1.2菌株和細(xì)胞
唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)ZJBF 005、大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 25922、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 14028和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)團(tuán)隊(duì)分離、鑒定和保存。
1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物
21日齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雌性昆明小鼠20只，體重(22±2)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1菌株的分離培養(yǎng)
采集北極狐空腸腸段內(nèi)容物1 mL裝于5 mL離心管，低溫條件下運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室。將離心管置于生物安全柜內(nèi)操作，離心管內(nèi)加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行振蕩混勻，吸取100μL混合液進(jìn)行梯度稀釋，隨即取10-5、10-6、10-7稀釋液100μL分別涂于MRS平板，置于恒溫培養(yǎng)箱。挑取單菌落在MRS平板中反復(fù)平板劃線以獲得純化菌株，篩選和保存革蘭氏陽(yáng)性菌株，對(duì)純化后的菌株進(jìn)行凍干保存。
1.2.2菌落形態(tài)及染色
取凍干菌粉于MRS液體試管中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后傳代，蘸取少量菌液采用平板劃線法培養(yǎng)單菌落，觀察菌落顏色和形態(tài)，采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色后，顯微鏡觀察。
1.2.3 16S rRNA基因序列測(cè)定
將待測(cè)菌株培養(yǎng)24 h后提取該細(xì)菌基因組DNA。以細(xì)菌基因組DNA作為目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，菌株的保守序列約為1 500 bp，將片段長(zhǎng)度正確的PCR產(chǎn)物送至天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。從GenBank中獲取的基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過(guò)MEGA進(jìn)行比對(duì)建樹(shù)。
表1 PCR反應(yīng)體系
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