1.2試驗(yàn)方法
1.2.1重組質(zhì)粒pT-UL2-RFP構(gòu)建
重組質(zhì)粒pT-UL2-GFP-gpt用限制性內(nèi)切酶NheI-HF、BamH I-HF雙酶切，切除重組質(zhì)粒GFP-gpt表達(dá)盒，回收6.2 kb片段，質(zhì)粒pT-RFPNX用限制性內(nèi)切酶NheI-HF、BamH I-HF雙酶切，回收大小為711 bp RFP片段，通過T4 DNA連接酶將RFP替換GFP-gpt，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-UL2-RFP。
1.2.2重組病毒的制備、純化
DEV細(xì)胞適應(yīng)毒接種CEF(MOI=0.01)，吸附1～2 h后，按Lipofectamine 3000說明書轉(zhuǎn)染高純度質(zhì)粒pT-UL2-RFP。轉(zhuǎn)染后72～96 h，觀察細(xì)胞病變情況，待80%細(xì)胞產(chǎn)生病變后，反復(fù)凍融3次，接種于新鮮CEF單層的六孔培養(yǎng)板中，用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養(yǎng)液覆蓋，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。觀察熒光，挑取單個(gè)有紅色熒光的蝕斑，在細(xì)胞上重復(fù)多次傳代，直至所有的蝕斑都帶有紅色熒光，確定為純化的重組病毒。
1.2.3重組病毒基因組DNA的提取
取重組DEV病毒液437.5μL，加入蛋白酶K(20 mg/mL)12.5μL，10%SDS 50μL；56℃水浴1 h；分別用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次；取上清，加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉和兩倍體積的無水乙醇，-20℃放置30 min；12000 g離心10 min，去除上清后，70%乙醇洗滌沉淀一次，沉淀溶于30μL去離子水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4重組病毒鑒定重組病毒DNA用鑒定
引物ORFC17F、ORFC17R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送北京華大基因生物公司測(cè)序。
1.2.5一步生長(zhǎng)曲線
將重組病毒及其親本毒分別接種于8瓶25 cm2(MOI=0.01)的CEF中，接種后每隔12 h取出一瓶接毒細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清作為上清樣品，再加入1 mL含有1%FBS的M199細(xì)胞維持液，凍融后取上清作為細(xì)胞樣品。將重組病毒及親本毒的病毒懸液做10倍系列稀釋，取4個(gè)適宜稀釋度，接種新鮮的CEF單層96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接0.1 mL，每個(gè)稀釋度接5孔，37℃吸附1 h后每孔加入0.1 mL細(xì)胞維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect，CPE)，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50，并繪制一步生長(zhǎng)曲線。
1.2.6重組病毒的穩(wěn)定性
將重組病毒接種CEF(MOI=0.01)，待80%細(xì)胞產(chǎn)生病變后，反復(fù)凍融3次，再接種CEF，按此方法連續(xù)傳代12次。熒光顯微鏡下觀察每代重組病毒的紅色熒光表達(dá)情況。按1.2.3方法提取第5代、第10代、第12代病毒DNA，用鑒定引物ORFC17F、ORFC17R通過PCR鑒定外源基因RFP是否穩(wěn)定存在。PCR產(chǎn)物送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。
2結(jié)果與分析
2.1重組質(zhì)粒pT-UL2-RFP的酶切鑒定
重組質(zhì)粒pT-UL2-RFP用限制性內(nèi)切酶NheI-HF以及BamH I-HF雙酶切鑒定，得到大小約為6.2 kb和771 bp的兩個(gè)片段(圖1)，符合理論值。
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