2結果
2.1真陰性與假陰性標本的生長曲線分布
2180瓶標本經(jīng)“金標準”確認，110瓶為假陰性，假陰性率為5.05%，其中99.09%(109/110)符合Ⅲ~Ⅷ型，79.09%(87/110)符合Ⅲ型生長曲線，2.73%(3/110)符合Ⅳ型，17.27%(19/110)符合Ⅴ或Ⅵ型，僅0.91%(1/110)符合Ⅰ型。2070瓶真陰性標本中98.50%(2039/2070)符合Ⅰ型，1.50%(31/2070)符合Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ型。見表2。
2.2采血量不規(guī)范和抗生素濫用與不典型生長曲線的關系
99.47%(2059/2070)真陰性標本的生長曲線符合Ⅰ型，目測采血量正常，其余0.53%(11/2070)真陰性標本符合Ⅵ型，目測采血量均明顯過多。97.27%(107/110)的假陰性標本采血量不符合要求或在采樣前使用了抗生素，2.73%(3/110)的假陰性標本采血量基本符合要求，采樣前也未使用抗生素。見表3。
表3110瓶假陰性標本的抗生素使用情況、采血量和生長曲線類型(n)
注:a，頭孢吡肟鈉;b，頭孢曲松鈉+左氧氟沙星;c，氨芐西林+頭孢曲松鈉;d，青霉素鉀;e，克林霉素磷酸酯+左氧氟沙星;f，未用抗生素。
2.3細菌耐藥分析
采樣前使用抗生素的85瓶假陰性標本中共培養(yǎng)出細菌85株，包括肺炎克雷伯菌25株、鮑曼不動桿菌18株、大腸埃希菌15株、醋酸鈣不動桿菌14株和金黃色葡萄球菌13株，其對頭孢吡肟、頭孢曲松、左氧氟沙星、氨芐西林、青霉素和克林霉素的耐藥率均較高。見表4。
表4使用抗生素的假陰性標本的細菌耐藥率(%)
2.4A、B兩種方法的篩選效能比較
以方法A為參考，分析方法B對假陰性標本的篩選效能。方法A結果與“金標準”方法完全一致，其準確率、特異性、敏感性和陽性預測值均為100.0%。方法B篩選出140瓶陽性和2040瓶陰性，109瓶陽性和2039瓶陰性與“金標準”方法均相符。方法B的敏感性和特異性與方法A比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2值分別為0.90和2.01，P均>0.05)，但其準確率和陽性預測值低于方法A(χ2值分別為32.13和54.23，P均<0.01)。見表5。
3討論
目前全自動血培養(yǎng)儀的應用越來越普及，但其假陰性是一個常被忽略的問題，假陰性率的高低與儀器的性能有關，不同類型的血培養(yǎng)儀因檢測原理不同，性能差別也較大。已知血培養(yǎng)儀的檢測原理有4種:
(1)電導法，根據(jù)在細菌生長過程中引起的導電性能變化檢測細菌生長;
(2)壓力監(jiān)測法，細菌生長過程中會消耗氧氣，產(chǎn)生CO2，引起壓力變化;
(3)熒光法，包括熒光遞增檢測法和熒光遞減檢測法;
(4)比色法，大多數(shù)細菌和真菌在生長過程中會產(chǎn)生CO2，與瓶底顯色物質反應，引起顏色改變，該方法結果重復性好和成本低，應用最廣泛，DL?bt64血培養(yǎng)儀采用的就是該法。上述所有類型血培養(yǎng)儀的共同缺點是瓶內(nèi)的抗生素易導致假陰性。除此之外，比色法血培養(yǎng)儀還有血細胞自身代謝產(chǎn)生的CO2易干擾細菌生長監(jiān)測等缺點。因此，在排查假陰性原因時，需要考慮拮抗劑對抗生素的拮抗能力、培養(yǎng)瓶的性能、濫用抗生素以及采血量是否符合廠家說明書要求等因素。鑒別假陰性的傳統(tǒng)方法是培養(yǎng)物盲種法(“金標準”)或培養(yǎng)物涂片法，雖準確度高，但效率低，工作量巨大。假陰性標本的生長曲線難以被監(jiān)測系統(tǒng)識別，被稱為“不典型生長曲線”，但可以通過人工識別。因此，人工閱讀不典型生長曲線有望成為快速篩選假陰性標本的新方法。
表5A、B兩種方法的篩選效能比較
此外，筆者在分析Ⅲ型不典型生長曲線的形成原因時發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型曲線的特點是延遲抬頭，本研究中79.09%的假陰性標本符合Ⅲ型。標本中含有抗生素，可以導致細菌生長遲緩。盡管培養(yǎng)瓶中含有吸附性樹脂，但尚未被吸附的低水平抗生素仍能影響細菌生長速度。培養(yǎng)瓶中細菌濃度過低，或采樣量過少，經(jīng)過較長時間繁殖增長后才能進入對數(shù)生長期，影響檢測結果。某些苛養(yǎng)菌或兼性厭氧菌在體外生長緩慢或培養(yǎng)困難，也可以導致細菌生長曲線難以突破閾值。在本研究中，采樣前使用抗生素的標本分離到的細菌耐藥性較高，原因可能是抗生素濃度未達到細菌的殺菌濃度，誘導細菌產(chǎn)生了耐藥性。
耐藥性細菌在低濃度抗生素環(huán)境下仍能緩慢生長，但在設定的培養(yǎng)時間內(nèi)無法突破閾值，可以形成Ⅲ型生長曲線。部分標本在采樣前未使用抗生素，但生長曲線也符合Ⅲ型，進一步分析后發(fā)現(xiàn)采樣量過少，導致細菌濃度低，生長緩慢，生長曲線無法突破閾值，這與已有的報道結果相符。Ⅳ型曲線的特點是起點位于閾值線下，多在2~3d內(nèi)抬頭，但始終無法突破閾值。某些菌株的CO2產(chǎn)量低，或瓶底顯色模塊中的指示劑變質，均可能導致生長曲線進入平臺期后仍無法突破閾值，形成Ⅳ型生長曲線。本研究中2.73%的假陰性標本的生長曲線符合Ⅳ型，采血量符合規(guī)范，也未發(fā)現(xiàn)抗生素濫用，是否與CO2產(chǎn)量少或顯色模塊指示劑質量有關，其原因還需要進一步研究。Ⅴ和Ⅵ型生長曲線的共同特點是起始點高于閾值線，提示上機前瓶內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生了較多的CO2，將瓶底顯色底物大部分或完全消耗。
從本研究中的表2和表4可以看出，在采血量過多時，無論真陰性還是假陰性，以及是否濫用抗生素，均有可能將顯色物質提前耗盡，形成Ⅵ型生長曲線。部分假陰性標本符合Ⅴ型生長曲線，可能是由于顯色底物未被血液標本自身耗盡，細菌的生長仍然可以形成“S”形，但由于抗生素的抑制作用或剩余的顯色底物過少，曲線的變化速率較低，被儀器誤識別為陰性。
本研究中有17.27%的假陰性標本的生長曲線符合Ⅴ型或Ⅵ型，采血量均過多。當然，Ⅵ型生長曲線尚不能排除標本中細菌起始量過多的因素。Ⅶ型和Ⅷ型生長曲線不具備細菌生長的“S”形特點，原因可能是過多的血液細胞代謝產(chǎn)生的CO2所致。本研究中未見符合Ⅶ型和Ⅷ型生長曲線的假陰性標本。部分真陰性標本符合Ⅶ型或Ⅷ型，可能與采血量過多有關。
此外，本研究中1例假陰性標本符合Ⅰ型生長曲線，患者在采樣前使用了抗生素，可能因為培養(yǎng)瓶中抗生素濃度較高，導致在培養(yǎng)期間生長曲線不抬頭，由于耐藥性，細菌仍保持一定的活性，故而被“金標準”方法檢出，但不能通過生長曲線將其與真陰性標本相鑒別。假陰性的主要原因是產(chǎn)生的CO2過多或過少，導致生長曲線無法滿足儀器判讀要求，與典型的陰性或陽性生長曲線區(qū)別明顯。
本研究對2180例陰性血培養(yǎng)標本進行匯總分析，發(fā)現(xiàn)99.09%的假陰性標本為Ⅲ~Ⅷ型不典型生長曲線，因此嘗試采用人工閱讀生長曲線來鑒別假陰性，該方法在國內(nèi)外尚未見報道。筆者分析后發(fā)現(xiàn)，該方法漏檢了1例假陰性，漏檢率僅為0.91%，準確率、特異性和敏感性均在98%以上，完全能夠滿足臨床需求。該方法的陽性預測值僅為77.86%，低于培養(yǎng)物涂片法。因涂片法的結果與“金標準”完全一致，可以使用涂片法彌補該法陽性預測值低的缺點。通過人工閱讀生長曲線將疑似假陰性瓶快速篩選出來，再通過涂片法確認，相比于對全部陰性標本進行盲種培養(yǎng)或涂片鏡檢，大大降低了工作量，值得推廣。綜上所述，濫用抗生素、采血量過多或過少可以導致假陰性的形成，雖然大多數(shù)品牌的培養(yǎng)瓶中已經(jīng)添加了樹脂或活性炭，但對抗生素的吸附能力有限，不能完全消除假陰性。
通過人工閱讀不典型生長曲線，敏感性、準確率和特異性接近涂片法，能夠高效篩選疑似假陰性標本，亦能輔助查找假陰性原因，值得推廣。此外，該法陽性預測值偏低的缺點，可以通過涂片法彌補。由于大多數(shù)血培養(yǎng)儀都采用比色法監(jiān)測細菌生長，因此，本研究的結果對其他同類血培養(yǎng)儀也有很高的參考價值。
人工閱讀不典型生長曲線鑒別血培養(yǎng)假陰性標本的臨床意義（一）
人工閱讀不典型生長曲線鑒別血培養(yǎng)假陰性標本的臨床意義（二）
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