考慮到未經(jīng)處理和PL處理的枯草桿菌孢子的萌發(fā)和隨后的營養(yǎng)生長，通過修改兩種處理之間的時間來評估亞致死通量（0.5 J/cm2）誘導(dǎo)的熱敏感性的持續(xù)性。為此，將枯草桿菌孢子懸浮在水或營養(yǎng)肉湯（TSB）中，并在4或30°C下儲存不同時間，然后再進行熱處理。
圖4。 亞致死PL預(yù)處理（0.5 J/cm2）后枯草桿菌孢子的熱敏性（90°C，10分鐘） )在30°C（填充符號）或4°C（空符號）下存儲期間 在蒸餾水（a）或營養(yǎng)培養(yǎng)基（TSB）（b）中：孢子PL預(yù)處理，但不接受后期熱處理（PL預(yù)處理對照）( ■), 孢子孵化和 進行熱處理，但之前未進行PL預(yù)處理（熱處理 控制）( ▲) 孢子PL經(jīng)過預(yù)處理和后熱處理 ( ●). 誤差線表示95%水平的置信區(qū)間。 連續(xù)線顯示 枚舉檢測級別。
在水中儲存24小時不會影響經(jīng)過預(yù)先PL處理（0.5 J/cm2）的枯草桿菌孢子的可培養(yǎng)性，也不會影響未處理孢子（未經(jīng)PL預(yù)處理）的加熱敏感性（90°C，10分鐘）（圖4a）。B、亞致死光致發(fā)光預(yù)處理（0.5 J/cm2）后，枯草桿菌孢子在4或30°C的水中保存至少24小時，保持增強的熱敏性（與兩種處理的單獨效應(yīng)之和相比，額外減少0.7 Log）。因為發(fā)現(xiàn)先前光致發(fā)光預(yù)處理誘導(dǎo)的熱敏性與處理之間經(jīng)過的時間無關(guān)，暴露于PL對枯草桿菌孢子造成的損害可能是不可逆的。
通過在熱處理之前將枯草桿菌孢子放置在TSB（4或30°C）中不同時間，也評估了亞致死PL預(yù)處理（0.5 J/cm2）誘導(dǎo)的熱敏感性的持續(xù)性。暴露于0.5 J/cm2的通量（未經(jīng)熱處理）不會影響枯草桿菌在30°C下培養(yǎng)期間的可培養(yǎng)性，并且在PL處理后至少24小時存活細胞數(shù)保持恒定（約108個細胞/毫升）（圖4b）。當對枯草桿菌孢子進行熱處理時，未經(jīng)處理和PL預(yù)處理的枯草桿菌細胞在30°C下培養(yǎng)期間的耐熱性降低。然而，在1小時之前，未發(fā)現(xiàn)熱敏性顯著增加。在此期間，培養(yǎng)物的光密度降低到初始值的約50–60%（圖3），這與孢子從亮相到暗相的變化有關(guān)。枯草芽孢桿菌細胞（未經(jīng)處理和PL處理的細胞）在30°C下培養(yǎng)1至3小時后，對熱處理的耐受性顯著降低。細菌孢子在此期間萌發(fā)，這通過相差顯微鏡進行了驗證。正如其他研究所表明的那樣（Nicholson等人，2000年；Setlow，2006年），營養(yǎng)細胞對熱處理的抵抗力不如孢子。從3小時到24小時，枯草桿菌細胞的敏感性沒有顯著增加。
之前指出的協(xié)同效應(yīng)，即先前光致發(fā)光處理引起的熱敏性增強，一直保持到潛伏期結(jié)束（24小時）。當在加熱之前應(yīng)用光致發(fā)光預(yù)處理時，發(fā)現(xiàn)熱處理（無光致發(fā)光預(yù)處理）誘導(dǎo)的細胞失活額外減少1.5對數(shù)。關(guān)于在4°C下的儲存，在儲存期間觀察到未處理和PL處理的孢子的耐熱性略有下降（圖4b）。4°C下的耐熱性損失低于30°C下的耐熱性損失。這一事實可能歸因于冷藏降低了芽孢桿菌孢子萌發(fā)的事實（Markland等人，2013年）。
如前所述，暴露在0.5 J/cm2的通量下不會影響孢子萌發(fā)率（圖3）。因此，可以排除亞致死光致發(fā)光處理（0.5 J/cm2）可能激活休眠孢子并促進萌發(fā)，這將導(dǎo)致快速喪失耐熱性，如雙重?zé)崽幚恚↙ovdal等人，2011）或高壓處理后再進行相對溫和的熱處理所示（Melt，1998；Vercammen等人，2012）。
3.3.熱處理后PL處理對枯草桿菌孢子失活的影響
在確定PL預(yù)處理對枯草芽孢桿菌孢子對后續(xù)加熱的抗性的影響后，研究了熱處理作為PL施用前的預(yù)處理的效果。圖5顯示了在單獨PL（0.4或0.5 J/cm2）、熱處理（90°C 5、10、15或20分鐘）或加熱后進行PL處理的枯草桿菌孢子的可培養(yǎng)性。
圖5。PL處理（0.4或0.5 J/cm2）對熱預(yù)處理（90°C：5、10、15或20分鐘）后枯草桿菌孢子數(shù)的影響。誤差線表示95%水平的置信區(qū)間。
在90°C下加熱5或10分鐘（不進行PL后處理）會導(dǎo)致枯草桿菌孢子輕微失活（處理5和10分鐘的對數(shù)分別減少0.3和0.6）。如前所述，枯草芽孢桿菌的熱預(yù)處理提高了后續(xù)PL處理的抗菌作用。即使在0.4 J/cm2的注量下發(fā)現(xiàn)枯草桿菌孢子對隨后的光致發(fā)光處理有熱致敏作用，但在0.5 J/cm2的注量下更為明顯。事實上，在90°C下加熱5分鐘，然后暴露在0.4 J/cm2的通量下，導(dǎo)致枯草桿菌計數(shù)減少1.8對數(shù)，而在0.5 J/cm2的通量下觀察到4對數(shù)減少。此外，當熱預(yù)處理時間較長時，PL誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌數(shù)量減少。在90°C下加熱5分鐘后，0.4 J/cm2的注量導(dǎo)致1.8對數(shù)減少，而在90分鐘下加熱10分鐘、15分鐘和20分鐘后，枯草桿菌計數(shù)分別減少2.1、3.7和5.7對數(shù)。PL和熱處理的組合可以使用比單獨使用熱時孢子失活所需的溫度更低或處理時間更少的溫度。這樣，在90°C下加熱20分鐘導(dǎo)致枯草芽孢桿菌計數(shù)減少約2對數(shù)，而當PL處理（0.4 J/cm2）之前進行較弱的熱處理（90°C下僅5分鐘）時，發(fā)現(xiàn)類似的減少。
在所有情況下，觀察到兩種技術(shù)（熱處理和PL）之間對微生物失活的協(xié)同作用與其各自作用的總和相比（圖5）。這些結(jié)果與早期關(guān)于紫外線的研究一致，該研究報告稱，在熱處理后存活的大腸桿菌細胞對隨后的紫外線輻射更為敏感（Okuda，1974）。當紫外線處理之前進行加熱預(yù)處理時，也發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢分生孢子的協(xié)同失活（Marquenie等人，2002）。相比之下，最近發(fā)表的一項研究表明，之前在60°C下處理3.58分鐘不會使凝結(jié)芽孢桿菌對隨后的紫外線處理敏感（Gayán等人，2013）。然而，熱處理的溫度低于本研究中使用的溫度，可能不足以提高孢子對后續(xù)紫外線處理的敏感性。
處理的順序似乎對枯草桿菌孢子的失活有重大影響。在滅活枯草桿菌孢子方面，先加熱后PL的順序最有效。當孢子先前暴露于90°C下10分鐘時，在0.5 J/cm2的通量下，孢子對數(shù)減少了4次以上（圖5），而當應(yīng)用相反順序時，觀察到2.4次對數(shù)減少（圖2）。加熱和光照相結(jié)合所觀察到的更大的協(xié)同效應(yīng)可能是因為熱處理可以觸發(fā)孢子萌發(fā)，這將對光照敏感，而光照預(yù)處理不會誘導(dǎo)孢子萌發(fā)。另一方面，與PL處理相比，熱處理可能導(dǎo)致更多的亞致死損傷，導(dǎo)致對后續(xù)處理的敏感性增加。同樣，以前也有報道稱，其他技術(shù)的微生物失活程度取決于應(yīng)用治療的順序（Gayán等人，2013；Marquenie等人，2002；Palgan等人，2012；）。
由于枯草桿菌孢子的微生物膜可能會被光致發(fā)光破壞（Wekhof等人，2001），光致發(fā)光敏感性的增加可能是由于熱引起的細胞膜結(jié)構(gòu)的額外變化（熱預(yù)處理）。此外，正如之前在UV處理中所證明的（Okuda，1974），熱處理可以抑制修復(fù)機制，防止PL誘導(dǎo)的損傷得到修復(fù)。
3.4.在30°C或4°C下儲存期間熱預(yù)處理后枯草桿菌孢子對PL處理的敏感性
通過監(jiān)測細胞懸浮液的OD600來評估經(jīng)過熱預(yù)處理（90°C，10分鐘）的枯草桿菌孢子的萌發(fā)和隨后的營養(yǎng)生長。當枯草芽孢桿菌孢子懸浮在水中（無營養(yǎng)物質(zhì)）時，未檢測到孢子萌發(fā)，未經(jīng)處理和PL處理的樣品之間沒有差異（圖6）。在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)表明，未經(jīng)處理和熱預(yù)處理的孢子的OD600類似下降，這表明在90°C下加熱10分鐘對孢子萌發(fā)率沒有實質(zhì)性影響。另一方面，未經(jīng)處理的孢子在孵育1小時后開始指數(shù)生長階段，而對于經(jīng)過先前熱處理的孢子懸浮液，在3小時前未觀察到OD600增加。為了評估熱預(yù)處理誘導(dǎo)的敏感性增強的持續(xù)性，在萌發(fā)和生長過程的不同階段對枯草桿菌孢子進行PL處理。
圖6?？莶菅挎邨U菌孢子萌發(fā)和營養(yǎng)生長的比較：TSB中未經(jīng)處理的孢子（對照）(?),孢子在90°C的水熱處理中暴露10分鐘，然后在TSB中孵化（–），未經(jīng)處理的孢子或孢子在90°C的水熱處理中暴露10分鐘，然后在水中孵化（–）。在30°C下，通過OD600的變化測量發(fā)芽和營養(yǎng)生長。
圖7。在蒸餾水（a）或營養(yǎng)介質(zhì)（TSB）中以30°C（填充符號）或4°C（空符號）儲存期間，熱預(yù)處理（90°C，10分鐘）后枯草桿菌孢子對PL處理（0.5 J/cm2）的敏感性（B）：在沒有先前熱處理的情況下孵化并進行PL處理的孢子（PL處理對照）(■),經(jīng)熱預(yù)處理但未經(jīng)后PL處理的孢子（熱預(yù)處理對照）(▲)對孢子進行熱預(yù)處理，并對其進行0.5J/cm2的后PL處理(●).誤差線表示95%水平的置信區(qū)間。連續(xù)線顯示檢測級別。
圖7顯示了未經(jīng)處理和熱處理的孢子對PL處理的存活率，這些孢子在受到PL處理之前存儲了不同的時間。如前所示，在水中存儲24小時不會影響未經(jīng)處理的孢子（未經(jīng)熱預(yù)處理）對PL的敏感性或枯草芽孢桿菌孢子在90°C下10分鐘的可培養(yǎng)性（圖7a）。此外，經(jīng)熱預(yù)處理的枯草芽孢桿菌孢子在4或30°C下保存至少24小時后仍對PL敏感。
在PL處理之前，將枯草芽孢桿菌孢子放置在TSB（4或30°C）中不同時間，以評估增強的PL敏感性的持續(xù)性。未經(jīng)處理和熱預(yù)處理的孢子在30°C孵育期間對PL處理的抵抗力均下降（圖7b）。在孵化的最初幾個小時（1-3小時）內(nèi)，這種對PL處理的耐藥性喪失是明顯的，而枯草桿菌細胞對PL的敏感性在孵化后（長達24小時）沒有增加。盡管孢子萌發(fā)開始于1小時之前，如OD600下降所示（圖6），枯草芽孢桿菌細胞在萌發(fā)過程結(jié)束前仍保持其抗性。根據(jù)之前的研究表明，孢子對PL處理的抵抗力比營養(yǎng)種群大得多（Dunn等人，1989年；Levy等人，2012年），枯草芽孢桿菌孢子在3小時后萌發(fā)。萌發(fā)后，細胞在6到24小時內(nèi)對熱處理同樣敏感。此外，熱預(yù)處理的枯草桿菌細胞在30°C的TSB中儲存期間至少24小時對PL保持敏化（圖7b）。在4°C下，經(jīng)過熱預(yù)處理后，枯草桿菌孢子仍然對PL敏感。然而，在該貯藏溫度下，在TSB中培養(yǎng)期間，觀察到對后續(xù)PL處理的耐受性略有下降。由于使用相襯顯微鏡進行了驗證，制冷條件不足以有利于完成孢子萌發(fā)。
3.5.枯草芽孢桿菌孢子在30°C或4°C貯藏期間經(jīng)PL預(yù)處理后對PL處理的敏感性
在確定光致發(fā)光和熱處理的聯(lián)合效應(yīng)后，在萌發(fā)和生長過程的不同階段評估亞致死光致發(fā)光處理（0.5 J/cm2）對枯草桿菌孢子對第二次光致發(fā)光處理（0.5 J/cm2）的抗性的影響。在30°C和4°C的條件下，在水中儲存24小時，不會影響雙PL處理的有效性，無論處理之間經(jīng)過多長時間，都觀察到類似程度的孢子失活（圖8a）。
圖8?？莶菅挎邨U菌孢子在蒸餾水（a）或營養(yǎng)介質(zhì)（TSB）中30°C（填充符號）或4°C（空符號）儲存期間，經(jīng)過亞致死PL預(yù)處理（0.5 J/cm2）后對PL處理（0.5 J/cm2）的敏感性（B）：孢子PL預(yù)處理，但未進行后PL處理（PL預(yù)處理對照）(■),在未進行PL處理的情況下孵化并進行PL處理的孢子（PL處理對照）(▲)孢子PL預(yù)處理后再進行0.5J/cm2的PL處理(●).誤差線表示95%水平的置信區(qū)間。連續(xù)線顯示檢測級別。
當枯草芽孢桿菌孢子被放置在誘導(dǎo)孢子萌發(fā)（TSB）的營養(yǎng)肉湯中時，在30°C下孵化期間發(fā)現(xiàn)對PL的敏感性增加（圖8b）。枯草芽孢桿菌細胞的這種耐藥性喪失在孵化的前幾個小時（1-3小時）尤為明顯，而在孵化后（直到24小時），對PL的敏感性沒有顯著增加。雖然枯草芽孢桿菌孢子在1小時之前開始萌發(fā)過程（圖4），但直到萌發(fā)過程的最后階段，它們才完全失去對PL的抗性，在3到24小時內(nèi)同樣敏感。
此外，當枯草桿菌孢子接受亞致死PL預(yù)處理時，與每個PL處理的個體效應(yīng)相比，觀察到對PL更敏感（圖8b）。PL處理之間在30°C下儲存24小時后，枯草桿菌6的細胞數(shù)減少了5.5 Log。然而，未經(jīng)處理的孢子的單獨PL處理或未經(jīng)第二次PL處理的PL預(yù)處理分別導(dǎo)致枯草桿菌計數(shù)減少2.5和1 Log。因此，先前暴露于亞致死劑量使枯草桿菌孢子對第二次PL處理敏感。亞致死通量引起的敏感性增強可能是由于修復(fù)機制受到抑制或亞致死損傷的存在，這將使枯草桿菌孢子更容易受到第二種PL。
本研究的結(jié)果清楚地表明，暴露于亞致死處理會使枯草桿菌孢子對后續(xù)處理敏感。這種增強的靈敏度在4或30°C的水中保存至少24小時（即以孢子形式保持靈敏度）。此外，在亞致死處理下存活的枯草桿菌孢子在孢子萌發(fā)后仍然對后續(xù)處理敏感。在減少枯草芽孢桿菌數(shù)量方面，加熱后的PL是最有效的組合。雖然需要進一步研究以闡明熱和光協(xié)同作用的機制，但這些處理組合似乎是傳統(tǒng)方法的一種有希望的替代方法，以確保微生物安全，同時不損害食品質(zhì)量。
致謝
巴斯克政府環(huán)境、領(lǐng)土規(guī)劃、農(nóng)業(yè)和漁業(yè)部為這項工作提供了支持。M、L.Artíguez由巴斯克政府教育、大學(xué)和研究部的博士資助。
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