[目的]為了開發(fā)一種能夠預(yù)防感染、阻止?jié)摲诮⒌呢埌捳畈《劲裥?FHV-1)弱毒疫苗，利用同源重組以及CRISPR/Cas9技術(shù)將FHV-1的gIgE基因替換為紅色熒光蛋白基因(RFP)。[方法]構(gòu)建針對(duì)gIgE基因的3條sgRNA及表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒，將含有sgRNA及Cas9蛋白的質(zhì)粒與含有RFP的轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染到貓腎細(xì)胞(F81)，通過噬斑純化以及有限稀釋方法進(jìn)行病毒純化，以重組病毒感染F81細(xì)胞連續(xù)10 代驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性，通過測(cè)定重組病毒以及親本病毒H07的病毒滴度、一步生長(zhǎng)曲線以及判斷噬斑大小評(píng)價(jià)其生物學(xué)特性。[結(jié)果]成功構(gòu)建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并將其命名為FHV-ΔgIgE-RFP; 提取重組病毒DNA，通過PCR驗(yàn)證gIgE基因無目的條帶，表明重組病毒純化成功，再通過PCR驗(yàn)證RFP基因有目的條帶，表明重組病毒成功插入外源基因。病毒滴度測(cè)定結(jié)果顯示，與親本病毒相比重組病毒的病毒滴度下降了90%; 在F1—F10連續(xù)傳代過程中RFP熒光表達(dá)且無減弱現(xiàn)象，表明重組病毒可穩(wěn)定表達(dá)外源基因; 測(cè)定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生長(zhǎng)曲線，重組病毒的生長(zhǎng)趨勢(shì)與親本病毒大致相同，表明插入外源基因并不會(huì)改變病毒本身的生長(zhǎng)特性; 噬斑觀察及染色結(jié)果顯示，在病毒感染細(xì)胞前、后期，重組病毒的噬斑都小于親本病毒，表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[結(jié)論]成功構(gòu)建并篩選出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株，為開發(fā)皰疹病毒弱毒活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。
引言
貓皰疹病毒Ⅰ型(feline herpesvirusⅠ,FHV-1)屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科,自1958年分離得到以來被認(rèn)為是最具臨床意義的可以引起貓呼吸系統(tǒng)疾病的病原體,也是引起貓眼部疾病的重要原因。臨床上導(dǎo)致幼貓罹患病毒性呼吸系統(tǒng)疾病的病原因子中約50%都是由于感染了FHV-1的緣故。FHV-1感染后的潛伏期一般為2～6 d,所致的典型臨床癥狀為貓眼鼻處出現(xiàn)大量漿液性分泌物,患貓精神沉郁、食欲不振、打噴嚏,眼部癥狀嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引發(fā)角膜出現(xiàn)潰瘍。感染FHV-1后很難徹底根治,原因是病毒可潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)中造成終生帶毒。當(dāng)貓免疫力低下或者處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí),潛伏于三叉神經(jīng)的病毒可快速復(fù)制并造成多次感染,且可間歇性通過眼鼻進(jìn)行排毒。因此臨床上所有康復(fù)的貓均有可能是帶毒動(dòng)物,成為其他健康貓的傳染源。檢測(cè)FHV-1血清和抗體呈陽性的貓占貓群的50%～75%。由于皰疹病毒的潛伏特性,因此開發(fā)一種能夠預(yù)防感染、阻止?jié)摲诮⒌囊呙缡直匾?。目?針對(duì)FHV-1的疫苗大多數(shù)是與貓杯狀病毒、貓瘟病毒聯(lián)合使用的多聯(lián)苗,但這些疫苗只能減輕臨床癥狀,并不能阻止病毒的脫落以及潛伏。
FHV-1基因組中有很多關(guān)鍵毒力基因,如胸苷激酶(TK)基因。TK缺失后不僅可以實(shí)現(xiàn)病毒的毒力下降,理論上還可以在缺失位點(diǎn)插入其他外源基因以改造病毒基因組,而這種致弱活疫苗載體甚至可以成為針對(duì)FHV-1的弱毒疫苗平臺(tái)。位于FHV-1基因組US區(qū)的gIgE基因也是其主要的毒力基因。當(dāng)gI或gE基因單獨(dú)表達(dá)時(shí),很難在細(xì)胞表面檢測(cè)到基因表達(dá)產(chǎn)物; 當(dāng)兩者共表達(dá)時(shí),其轉(zhuǎn)錄復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中運(yùn)輸并在細(xì)胞表面表達(dá)。這說明gI和gE需相互協(xié)作才能更好表達(dá)。糖蛋白gIgE在皰疹病毒家族中高度保守,屬于非必需糖蛋白。這類糖蛋白對(duì)于病毒生長(zhǎng)復(fù)制來說不是必需的,但缺失后能明顯改變病毒毒力。在偽狂犬病毒(PRV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、單純皰疹病毒(HSV-1)以及貓皰疹病毒(FHV-1)中,gI和gE糖蛋白是形成合胞體以及感染正常細(xì)胞所必需的磷酸蛋白,也是病毒感染宿主神經(jīng)系統(tǒng)的主要毒力基因。有研究表明,與野毒相比,接種gI或gE基因缺失株的動(dòng)物幾乎未在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出病毒,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是導(dǎo)致潛伏期建立的重要原因。鑒于此,本試驗(yàn)擬利用同源重組及CRISPR/Cas9技術(shù),將FHV-1的gIgE基因替換為紅色熒光蛋白基因(RFP),分析其體外生長(zhǎng)特性,為開發(fā)基于FHV-1弱毒疫苗載體以及相關(guān)多聯(lián)疫苗提供理論基礎(chǔ)。
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