正丙醇是高級(jí)醇之一，是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)之一。中國(guó)白酒有12種風(fēng)味類型，不同風(fēng)味類型中正丙醇的含量差異很大。例如正丙醇是中國(guó)名牌白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，如斯特酒（特味型）、茅臺(tái)酒（茅臺(tái)味型）、白云邊酒（混合型）。適量的正丙醇對(duì)白酒特殊香味的改善有一定的貢獻(xiàn)。但正丙醇含量高，嚴(yán)重影響白酒的口感和風(fēng)味，刺激人體黏膜，危害人體健康。白酒釀造過程中產(chǎn)生正丙醇的微生物存在爭(zhēng)議，大多數(shù)研究人員堅(jiān)持認(rèn)為釀酒酵母是正丙醇的主要生產(chǎn)者。釀酒酵母中的正丙醇是通過2-酮丁酸脫羧產(chǎn)生的。作為正丙醇的前體，2-酮丁酸的代謝與正丙醇的收率密切相關(guān)。近年來，關(guān)于在釀酒酵母中合成正丙醇存在不同意見。釀酒酵母中正丙醇合成的關(guān)鍵基因和代謝途徑尚不清楚。在本文中，研究人員關(guān)注了蘇氨酸、L-高絲氨酸和丙酮酸途徑以及將2-酮丁酸轉(zhuǎn)化為正丙醇以在釀酒酵母中合成正丙醇的途徑。共選取21個(gè)與正丙醇代謝密切相關(guān)的基因，研究其對(duì)正丙醇合成的影響。通過測(cè)定每個(gè)重組菌株中21個(gè)基因的表達(dá)量以及突變菌株中L-天冬氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、2-酮丁酸、丙酮酸、丙醛和正丁酸的含量，分析基因?qū)φ即x的調(diào)控作用。通過使用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵曲線的監(jiān)測(cè)，研究了正丙醇代謝相關(guān)基因缺失對(duì)突變菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的影響。同時(shí)也測(cè)定了每個(gè)重組酵母菌株產(chǎn)生的異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇的量。


Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用


將酵母菌株接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基(5 mL)中，并在30°C搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后將40μL酵母細(xì)胞液加入360μL YEPD培養(yǎng)基中，并將混合物轉(zhuǎn)移至96孔板中。通過Bioscreen自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng)（OY Growth Curves Ab Ltd.，Helsinki，F(xiàn)inland）每30分鐘測(cè)量600 nm處的光密度（OD 600）。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果


刪除正丙醇代謝相關(guān)基因以評(píng)估在正丙醇合成中的作用，以確定釀酒酵母生產(chǎn)正丙醇的關(guān)鍵基因和途徑。研究結(jié)果表明CYS 3、GLY 1、ALD 6、PDC 1、ADH 5和YML 082 W是影響酵母中正丙醇代謝的關(guān)鍵基因。n _與α5相比，α5ΔGLY 1、α5ΔCYS 3和α5ΔALD 6的丙醇濃度分別增加了121.75、22.75和17.78%。與α5相比，α5ΔPDC 1、α5ΔADH 5和α5ΔYML 082 W的正丙醇含量分別降低了24.98%、8.35%和8.44%。測(cè)定中間代謝物的含量，結(jié)果表明蘇氨酸途徑中甘氨酸和蘇氨酸的相互轉(zhuǎn)化和2-酮丁酸生成丙醛是正丙醇生成的核心途徑。此外，YML 082 W通過L-高絲氨酸直接生產(chǎn)2-酮丁酸，在正丙醇的合成中發(fā)揮了重要作用。

圖1、釀酒酵母中正丙醇的代謝途徑。圖中的三個(gè)色塊顯示了釀酒酵母中與正丙醇代謝相關(guān)的三個(gè)途徑，分別是L-高絲氨酸、蘇氨酸和丙酮酸途徑。小橢圓形圓圈中的基因分別被刪除。

圖2、每個(gè)重組菌株和親本菌株α5中的正丙醇含量。發(fā)酵后測(cè)定各重組菌株的正丙醇產(chǎn)量，研究代謝途徑基因敲除對(duì)酵母菌生產(chǎn)正丙醇的影響。結(jié)果表明，除α5ΔTHR 1、α5ΔTHR 4和α5ΔTHR 6外，所有重組菌株均能順利發(fā)酵。

圖3、突變體和α5基因表達(dá)水平的測(cè)定。每行代表與親本菌株α5相比，每個(gè)重組菌株中每個(gè)靶基因的表達(dá)水平。紅色和綠色表示與對(duì)照相比，靶基因的表達(dá)水平分別上調(diào)和下調(diào)。深色表示大幅上調(diào)或下調(diào)。與α5相比，最大上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)分別為21.731和1.18064×10–6。

圖4、重組菌株和親本菌株α5的生長(zhǎng)和發(fā)酵特性。(A)重組菌株和α5的生長(zhǎng)曲線。(B)各重組菌株和α5的CO2排放量。(C)每個(gè)重組菌株和α5的酒精含量。誤差條代表三個(gè)重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Bioscreen全生長(zhǎng)曲線分析儀用于測(cè)定親本菌株α5和各突變株在YEPD液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，研究正丙醇代謝途徑中正丙醇代謝相關(guān)基因缺失對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響。從生長(zhǎng)曲線的整體趨勢(shì)來看，突變體的生長(zhǎng)趨勢(shì)與α5基本相同。除了處于穩(wěn)定期的α5ΔALD 4和α5ΔALD 5外，在突變體之間沒有觀察到細(xì)胞密度的明顯差異。這表明正丙醇代謝途徑相關(guān)基因的缺失對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)性能沒有不利影響。

圖5、重組菌株和親本菌株α5的高級(jí)醇的形成。(A)各重組菌株中異丁醇和α5的含量。(B)各重組菌株和α5中異戊醇的含量。(C)各重組菌株中2-苯乙醇的含量和α5。誤差條代表三個(gè)重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。


總結(jié)


釀酒酵母生產(chǎn)的正丙醇對(duì)中國(guó)白酒的口感和風(fēng)味有顯著影響。刪除正丙醇代謝相關(guān)基因以評(píng)估在正丙醇合成中的作用，以確定釀酒酵母生產(chǎn)正丙醇的關(guān)鍵基因和途徑。結(jié)果表明CYS 3、GLY 1、ALD 6、PDC 1、ADH 5和YML082W是影響酵母中正丙醇代謝的關(guān)鍵基因。與α5相比，α5ΔGLY 1、α5ΔCYS 3和α5ΔALD 6的丙醇濃度分別增加了121.75、22.75和17.78%。與α5相比，α5ΔPDC 1、α5ΔADH 5和α5ΔYML 082 W的正丙醇含量分別降低了24.98%、8.35%和8.44%。測(cè)定中間代謝物的含量，研究結(jié)果表明蘇氨酸途徑中甘氨酸和蘇氨酸的相互轉(zhuǎn)化和2-酮丁酸生成丙醛是正丙醇生成的核心途徑。此外，YML 082 W通過L-高絲氨酸直接生產(chǎn)2-酮丁酸，在正丙醇的合成中發(fā)揮了重要作用。該研究為釀酒酵母中正丙醇的合成提供了有價(jià)值的見解，并為未來白酒釀造中酵母菌株的優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)。


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