I型鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由I型鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)引起的雛鴨的一種高度致死、快速傳播的病毒性傳染病。該病的特征為發(fā)病急、病程短、死亡率高。臨床癥狀為痙攣、抽搐和角弓反張等，主要病理變化以肝臟腫大和斑點(diǎn)出血為特征，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)一種重要的傳染病。
DVH首次報(bào)道于美國長島，隨后在許多國家和地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了該病疫情。1965年，我國報(bào)道了第一例DVH疫情，之后我國大部分省市和地區(qū)均報(bào)道了該病。目前，DHV-1的分離和培養(yǎng)仍然只能通過接種鴨胚或雞胚來實(shí)現(xiàn)。一般而言，DHV-1經(jīng)過若干代次的培養(yǎng)后，均可以在雞胚或鴨胚中得到良好的增殖，并達(dá)到較高的病毒滴度，這有利于DHV-1強(qiáng)毒株的致弱以及研制DHV-1減毒疫苗。但在研究DHV-1的致病機(jī)理和分子生物學(xué)等方面，卻有一定的局限性。研究表明，良好的細(xì)胞培養(yǎng)模型是開展病毒基礎(chǔ)研究的良好平臺，本研究在建立的鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF-h)系的基礎(chǔ)上，用DEF-h培養(yǎng)DHV-1，并研究其在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)和增殖規(guī)律，為研究DHV-1的致病機(jī)理及研制細(xì)胞滅活疫苗等提供參考。
1材料和方法
1.1病毒株及DEF-h細(xì)胞系
DHV-1 ZJ-08株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；DEF-h細(xì)胞系是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝體系將SV40的大T抗原整合到的DEF細(xì)胞染色體中，利用大T抗原的細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能而建立的穩(wěn)定傳代細(xì)胞系。
1.2主要試劑
rTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；FITC和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DHV-VP1抗體和DHV-1多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。
1.3病毒接種
DEF-h細(xì)胞將DHV-1 ZJ-08株研磨液(0.2 mL/孔)接種于單層的DEF-h細(xì)胞，37℃孵育1 h，棄病毒液，更換含10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變(CPE)。培養(yǎng)4 d后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，-80℃凍存?zhèn)溆谩?
1.4 RT-PCR檢測
收集培養(yǎng)48 h的3代DHV-1 DEF-h細(xì)胞提取病毒RNA。用特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，用特異性引物DHVF：5'-GGGGATGACTGTGTTCTG-3'，和DHVR 5'-GGG TATCCCACAACACTA-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增大小為471個(gè)核苷酸序列(6966 nt～7436 nt)。PCR反應(yīng)程序：95℃5 min；94℃1 min、53℃1 min、72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.5間接免疫熒光檢測
(IFA)將DEF-h細(xì)胞培養(yǎng)于35 mm培養(yǎng)皿中，接種第3代DHV-1。培養(yǎng)48 h后，用丙酮∶甲醇(1∶1)固定液4℃固定15 min。用5%脫脂乳37℃封閉30 min。以DHV VP1抗體(1∶200)為一抗，標(biāo)記以山羊抗兔FITC-IgG(1∶1000)為二抗，進(jìn)行IFA檢測。
1.6 Western blot檢測
將DHV-1細(xì)胞培養(yǎng)裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂乳封閉4℃過夜，以抗DHV-VP1多抗(1∶200)為一抗，以山羊抗兔HRP-IgG為二抗(1∶5000)，通過DAB法顯色進(jìn)行檢測。
1.7 DHV-1感染雞胚試驗(yàn)
將30枚9日齡SPF雞胚隨機(jī)分為兩組，每組各15枚。第1組接種DHV-1 ZJ-08株的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液(P3)，第2組接種DHV-1 ZJ-08株適應(yīng)雞胚的尿囊液(CF5)，接種量為0.2 mL/只。在37℃條件下孵化6 d，統(tǒng)計(jì)病毒致死雞胚的數(shù)量。
1.8一步生長曲線的繪制
將DEF-h細(xì)胞懸液接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3×105個(gè)/mL)，接種第3代DHV-1100μL/孔，倍比稀釋10-1～10-6，37℃2 h后，吸出病毒液，加入100μL完全培養(yǎng)基(含5%的胎牛血清)繼續(xù)于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察CPE，并記錄50%細(xì)胞產(chǎn)生病變的孔，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)組織感染量(TCID50)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制病毒在DEF-h中的一步生長曲線。
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